透明化マウス海馬組織におけるアストロサイトと興奮性ニューロンの2光子顕微鏡法

要約

出典: Refaeli, R., et al., Investigation of spatial interaction between astrocytes and neurons in cleared brains. J. Vis. Exp. (2022)

の準備を実演しています。蛍光標識されたアストロサイトと興奮性ニューロンとの間の空間的相互作用を視覚化するための2光子顕微鏡を用いた透明なマウス海馬組織のチャンバーとニューロイメージング。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.チャンバーの準備

注: 各サンプルには、サンプルが配置されるイメージングチャンバーを備えたスライドが必要です。

1. サンプルをスライドの中央に置きます。
2. ホットグルーガンを使用して、スライドの端にティッシュとほぼ同じ高さに壁を作成します。角の 1 つに小さな隙間 (約 5 mm) を空けてください (図 1A、B)。
3. 屈折率マッチング溶液またはRIMSをサンプルに1〜2滴塗布して、上面を湿らせ、カバーガラスと組織の間に気泡が形成されるのを防ぎます。
4. RIMS(屈折率マッチングソリューション)ドロップを塗布した直後に、ホットグルーの最後の層を壁に追加し(ブレイン/スライスの高さに達するように)、すぐに(ホットグルーがまだ液体である間に)ステップ1.5に進みます。
5. 上部をカバースリップで密封し、まだ温かいホットグルー層(図1C)の上部にできるだけ均等に置きます。
6. ホットグルーの壁に残された隙間からRIMSをチャンバーに充填します(図1D、E)。
7. ホットグルーで隙間を埋めます。内部に空気を入れないでください(図1F)。
8. ホットグルーの壁がスライドの境界を越えて伸びている場合は、伸びる端を切り取ります(Figure 1G)。
9. イメージングに使用する対物レンズが浸漬されている場合は、浸漬液が長持ちするように、カバーガラスの上の壁にさらに2〜3mmの接着剤を追加します(図1H)。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC ベクターコアファシリティ (EVCF)		アストロサイト検出用ウイルスベクター
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC ベクターコアファシリティ (EVCF)		ニューロン検出用ウイルスベクター
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		ニューロン核の検出に使用されるウイルスベクター
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		ニューロンの検出に使用されるウイルスベクター
Imarisソフトウェア	Bitplane, 英国		画像の3D解析ができるソフトウェア
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SyGlassソフトウェア			バーチャルリアリティを用いた画像の3D解析ができるソフトウェア
二光子顕微鏡	Neurolabware		Ti:sapphireレーザー(カメレオンディスカバリーTPC, コヒーレント)、GaAsP光電子増倍管(浜松ホトニクス、H10770-40)、バンドパスフィルター(セムロック)、水浸16倍対物レンズ(ニコン、0.8NA)
VA-044 開始剤	和光	#011-19365