異なる発生段階における小脳顆粒ニューロンのシナプス形成の可視化

要約

Source: Chan, U., et al., In vivo出生後のエレクトロポレーションを利用して、小脳顆粒ニューロンの形態とシナプスの発達を研究しています。 J. Vis. Exp. (2021)です。

このビデオでは、蛍光タンパク質で標識したマウスの脳組織切片をあらかじめ固定した画像化、共焦点顕微鏡による高解像度のzスタック画像の撮影、神経突起の長さ、樹状突起形成、表面積、体積などの構造パラメータの測定による小脳顆粒ニューロンの発達の解析を実演しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 小脳顆粒ニューロンまたはCGNの形態学的解析 - 三次元(3D)再構成と表面積および細胞容積

1. 画像共焦点顕微鏡で単一のエレクトロポレーションCGNを63倍対物レンズ、2倍ズームで撮影し、スタックあたり0.5μmでzスタック画像を撮影します。画像ウィンドウごとに 1 つのセルを画像化することで、画像の解析と再構成が容易になります。
2. 次のリンク(https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions)を使用してFIJI用のSimple Neurite Tracerプラグインをインストールすると、エレクトロポレーションCGNの構造を3次元(3D)空間で簡単かつ効率的にトレースできます。

注: プラグイン (https://imagej.net/SNT) の更新バージョンがあります。

3. 神経突起の長さと樹状突起の爪の形成を、Simple Nenuriteトレーサーを使用して盲検的に解析します。エレクトロポレーションCGNのシングルチャンネルzスタック画像をFIJIにアップロードし、[Plugins |セグメンテーション |シンプルな神経突起トレーサー (図 1D)。
4. ドロップダウンメニューにアクセスし、[新しい 3D ビューアを作成] (Figure 1D を選択します。
5. 樹状突起の基部までスクロールし、そこで細胞体に接続し、接合部をクリックしてパスを開始します。セルフィル信号が最も明るいセクションをクリックし、[y]を押してトレースを保持することにより、パスを手動でトレースします。樹状突起に爪がない場合は樹状突起の端まで、または爪の付け根までトレースし、[f]を押してパスを確認します(Figure 2D)。
6. 次に、構造の基部からパスを開始し、最も長い神経突起の終わりまでトレースして、爪をトレースします。2次および3次分岐をトレースするには、Windowsの場合は[ctrl]、Mac OSの場合は[alt]を押しながらパスをクリックします。[f]を押してパスを確認します。
7. トレースの測定値が別のウィンドウに表示されることを確認します。爪の枝(一次、二次、三次)のすべての測定値を合計して、各爪の全長を求めます。
8. エレクトロポレーションCGNの表面積と細胞体積を解析するには、Imaris細胞解析ソフトウェア(https://imaris.oxinst.com/)をダウンロードしてください。

注: FIJIは、すぐに利用できる無料のプラグインを使用して、zスタック画像から3Dで細胞を再構築するためにも使用できます。さらに、Simple Neurite Tracerにはボリュームレンダリング機能がありますが、以下に概説する理由でImarisを使用しました。

9. エレクトロポレーションCGNのzスタック画像をImarisにアップロードします。3D再構築ツールキットにアクセスするには、Surpassを押します。
10. CGN を再構築するには、[サーフェス] を押し、イメージ ウィンドウ内のセル全体を含む関心領域を選択します。終了したら、[作成]の下の右下隅にある青い前方矢印を押します。
11. 画像に異なる信号の複数のチャンネルが含まれている場合は、エレクトロポレーションされたCGNを含むチャンネルを選択し、青い前方矢印を押します。
12. サイドバーを使用して、エレクトロポレーションセルの信号に最も正確に適合する目的のしきい値を設定します。セルの表面に近づくように拡大して、閾値を正確に決定します。終了したら、二重の緑色の矢印を押してセルを再構築し、メタデータから表面積と体積サイズを取得します。

結果

材料