覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

要約

出典: Maruoka, H., et.al. 覚醒マウスにおけるミクログリアダイナミクスとニューロン活動の同時イメージング J. Vis. Exp. (2022)

このビデオは、視覚刺激中に覚醒マウスのニューロン活動とミクログリアダイナミクスをイメージングするための2光子顕微鏡法を示しており、カルシウムの過渡現象と細胞相互作用に焦点を当てています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

ミクログリアとニューロンのカルシウム動態のin vivo 2光子イメージング

1.マウスの顕微鏡装置への慣れ

1. 手術の3週間後、マウスに3%イソフルランで麻酔を誘発し、カスタムメイドの定位固定装置を使用して2光子顕微鏡の25倍対物レンズの下にマウスをセットします(図1C)。セットアップでは、マウスをトレッドミルの上部にセットし、自由に動かすことができます。
2. 約10分後、マウスを顕微鏡ステージから取り外し、ホームケージに戻します。2光子画像取得の前に、隔日で少なくとも3回慣れを繰り返します。

2. 二光子画像取得

注: ミクログリアの活性化は徐々に基底レベルに戻るため、手術後4週間以上経過してから画像取得を行うことをお勧めします。

1. 3%イソフルランでマウスに麻酔を誘発し、カスタムメイドの定位固定装置を使用してマウスを2光子顕微鏡の対物レンズの下にセットします。
2. 特注の遮光装置(Figure 1A、Figure 1B)と視覚刺激用の液晶モニター(Figure 1D)を設置します。
   1. レンズを脳表面に焦点を合わせるように配置してから、このレンズ位置を元のZ位置として設定します。x-y座標を一定に保ち、対物レンズを持ち上げます。マウスと脳定位固定装置を対物レンズとトレッドミルから取り外します。
   2. ヘッドプレートの上部に、炭粉を混ぜて黒ずんだシリコンを使用した遮光装置を取り付け、ヘッドプレートと遮光装置の間のスペースがしっかりと密閉されていることを確認してください。
   3. シェーディングデバイスに蒸留水を入れてから、マウスと脳定位固定装置フレームを対物レンズの下とトレッドミルに再度固定します。対物レンズの深さを確認しながら、脳表面の焦点面を慎重にリセットします。
      注: 対物レンズを損傷するリスクを避けるために、最初にxyz座標を設定してから、対物レンズのシェーディングデバイスを適用します。カバーを先に取り付けてから座標を調整するのも合理的ですが、このオプションでは取り扱いには注意が必要です。
   4. 対物レンズを黒色のアルミホイルで覆い、対物レンズによる視覚刺激に使用されるLCDモニターからの光の汚染を防ぎます(図1D)。10 インチ LCD モニターをマウスの目の前 12.5 cm にセットして、視覚刺激を提示します (図 1D
3. 蛍光発光収集フィルターはEGFP蛍光(525/50 nm発光フィルター)、R-CaMP蛍光(593/46 nm発光フィルター)に、励起波長は1,000 nmに設定します。25x 1.1 NA対物レンズとGaAsP PMTを使用して、0.25 μm/ピクセルの空間分解能で画像を取得します。
4. レイヤー2/3でR-CaMP(+)ニューロンとEGFP(+)ミクログリアを同時にイメージングできるイメージング領域を見つけます。この設定では、Figure 2 で取得したデータは、ライブ画像プレビューを使用して、ピアル表面から100 μmの深さにありました。励起レーザーの出力をできるだけ低く保ち、イメージング領域の局所温度の上昇による光退色や損傷を防ぎます。
5. 30 Hzのフレームレートで画像を取得します。画像取得と同時に、コントラスト100%、1.5 Hz、1度あたり0.04サイクル、0°から150°までの6方向、30°ステップでマウスにドリフトグレーティング視覚刺激を呈示します。
6. 画像取得後、マウスを顕微鏡ステージから取り外し、シェーディングデバイスと脳定位固定装置をマウスから取り外し、マウスをホームケージに戻します。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10インチ液晶モニター	EIZO	DuraVision FDX1003	グレーティング視覚刺激の提示用
ブラックアルミホイル	THORLABS	BKF12
CX3CR1-EGFPマウス	ジャクソン研究所	IMSR_JAX: 005582	CX3CR-1EGFP/+ ノックイン/ノックアウト 内因性Cx3cr1遺伝子座 の制御下にある脳内のミクログリア でEGFPを発現するマウス
デントシリコーン-V	松風株式会社	N/A	のシェーディング デバイスの取り付け用ヘッドプレート
ヘッドプレート	カスタマイズ	N/A	材質:SUS304 厚さ0.5mm
イソフルラン	ファイザー	N/A
多光子励起顕微鏡	ニコン	N/A	商用名は「A1MP+」
対物レンズ	ニコン	N/A	商用名は「CFI75 アポクロマート 25xC W」です。
サイクツールボックス		フリーソフト	グレーティング視覚刺激の提示用
シェーディングデバイス	カスタマイズ	N/A
固定装置	カスタマイズ	N/A	2光子下マウス固定用 顕微鏡
トレッドミル	カスタマイズ	N/A