蛍光顕微鏡法を用いたショウジョウバエの蛹眼のライブイメージング

要約

ソース: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、ショウジョウバエの蛹の目のパターンを研究するライブイメージング技術を示しています。緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きマーカーは、発生中の眼の構造形成中の細胞組織と分化の可視化を可能にします。

プロトコル

1. 蛍光イメージング

1. イメージ Drosophila 蛹の準備。7分ごとに、付着体接合部の領域にある眼神経上皮の頂端ドメインを通る連続切片を捕捉します。
   NOTE: a) 適切なシリアルセクションは、通常、Zスタックあたり4〜5個で、0.2μmのzステップで構成されています。b)軽度の隆起や折り目など、上皮のトポロジーの不規則性により、組織の大きな領域の焦点が合った画像を取得することが困難になる場合があります。イメージング中に、関心のある領域の一部が焦点を合わせ、隣接する領域が焦点が合っていないことに気付く場合があります。蛹の眼とカバースリップの間に蒸留水の小さな液滴を含めると、一部の急性組織のひだを排除できますが、蛹の眼の形態形成の初期段階に特徴的な軽度の不均一なトポロジーを排除できません。このような場合は、フィールド全体で焦点の合ったスライスが取得されるまで、zスタックを拡張して組織をオーバーサンプリングします。c)7分ごとにシリアル切片をキャプチャすることで、画質を損なう可能性のある緑色蛍光タンパク質(GFP)蛍光の強度を大幅に低下させることなく、3〜4時間のライブイメージングが可能になるはずです。時間間隔が短いと、イメージングの合計時間が短縮される場合があります。
2. 3〜4時間イメージングを続けます。多くの蛍光顕微鏡で利用可能な自動フォーカスおよび時間機能は、蛹の成長と血リンパのポンピングが網膜の位置を移動し、14〜21分ごとに用心深い再焦点合わせが必要であるため、使用しないでください。

NOTE: 4時間を超えるイメージングは、眼の形態形成を遅らせたり、遅らせたりする可能性があります。

3. 適切なデコンボリューションソフトウェアを使用して、背景を減らし、シリアルセクションの画像のコントラストを強化してください。各 z-stack ファイルについて、Leica Application Suite Advanced Fluorescence(LAS AF)ソフトウェアで次の手順を実行します。 [Tools] パネルに移動し、[3D Deconvolution] を選択して [Apply] をクリックします。
4. デコンボリューションされたスタックファイルごとに最大投影(MP)画像を生成する:[ツール]パネルに移動し、[3D投影]を選択して[適用]をクリックします。
   注: MPアルゴリズムは、オーバーサンプリングされた組織に対して均一に焦点が合った画像の生成に失敗するかもしれません。

2. 画像処理

1. 画像の自動配置:

注: ライブショウジョウバエ組織はイメージングプロセス全体を通じて移動し、成長します。その結果、連続する時点で収集された画像の中心は、<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Drosophilaティッシュ。さらに、網膜椎間板全体は、蛹形成 (APF) 後 ~21 時間から 23 時間の間に約 30° 回転します。個々の細胞の挙動を強調し、生物の成長によって引き起こされる注意散漫を減らすには、各MP画像を整列させます。これは手動で実行できますが、ここで使用する画像編集ソフトウェアには、プロセスを迅速化できるアルゴリズムが組み込まれています。

2. メインメニューの「ファイル」タブから、「スクリプト」を開き、「ファイルをスタックにロード」を選択します。
3. MP 画像ファイルを [レイヤーの読み込み] パネルにインポートし、[OK] を選択します。[ソース画像の整列を試行] オプションが自動的に選択されていないことを確認します。
4. NOTE: このオプションを選択すると、ソフトウェアは画像データを歪める整列アルゴリズムを使用するかもしれません。
5. すべてのMPファイルがレイヤーペインに読み込まれたら、最も古い時点がレイヤースタックの一番上になるように、すべての画像が時系列順になっていることを確認します。レイヤーの順序が正しくない場合は、レイヤーの順序が正しくなるまでドラッグアンドドロップします。
6. メインメニューの「編集」タブから「レイヤーの自動整列」を選択します。「再配置」を選択し、「OK」をクリックします。
7. 自動整列アルゴリズムがフレームを関連する焦点に向けられない場合は、移動ツールを使用して微調整を行います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
GMR-GAL4;UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ;+ / SM5-TM6b
UAS-dcr-2;UAS-a-cat:GFP、ubi-DE-Cadherin:GFP;+ / SM5-TM6b
25 x 75 x 1 mm ガラス顕微鏡スライド	フィッシャー・サイエンティフィック	12-550-413
22 x 40 mm ガラス・カバースリップ	VWR	48393-172
鉗子	ファイン・サイエンス・ツール	91150-20
ワットマン 3 mm クロマトグラフィー紙	フィッシャー・サイエンティフィ	05-713-336
ワセリン	フィッシャー・サイエンティフィック	19-086-291
30 mlシリンジ	フィッシャーサイエンティフィック	S7510-30
Adobe Photoshop CS5	Adobe
ライカ TCS SP5 DM顕微鏡	ライカマイクロシステムズ
LAS AF バージョン2.6.0.7266 顕微鏡ソフトウェア	ライカマイクロシステム

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