生きたマウス海馬における蛍光標識ニューロンの縦断的2光子イメージング

要約

出典:Ulivi, A. F., et.al.Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice. J. Vis. Exp. (2019)

}このビデオは、生きたマウスの蛍光標識されたピラミッド型ニューロンの縦方向の2光子イメージングを示しています。 海馬CA1領域のニューロン構造を研究するための樹状突起と樹状突起棘の調製、カニューレの整列、およびイメージングを紹介します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. イメージングセッションの準備
2. 事前にイメージングセットアップをオンにし、必要に応じてレーザーを温めて安定させます。
3. マウスに麻酔をかけます。マウスを1 L/min O₂の3%イソフルランで麻酔導入チャンバーに入れ、意識を失うまで待ちます。つま先つま先つまみ反射テストを使用して麻酔を評価します。
4. 鉗子を使用して、ヘッドホルダープレートから粘着フィルムを慎重に剥がします。マウスを手に持ち、ヘッドホルダープレートを指で持ちます。準備の損傷を避けるために、フィルムをそっと剥がします。
5. マウスを顕微鏡下、加熱カーペットの上に置き、ヘッドプレートをホルダーに固定します(図1D)。
6. 鼻を覆うようにノーズコーンを配置し、イソフルランを1.5〜2%に減らします。
7. マウスの目に眼軟膏を塗ります。
8. イメージングカニューレを脱イオン水ですすいで清掃します。シリンジと細い針を使用してカニューレに水を落とし、真空ポンプを使用して水を取り除きます。

2. イメージングセッション

1. }低倍率と長い作動距離の対物レンズを使用して、カニューレの残留水、汚れ、完全性、蛍光の存在を視覚的に確認します。
2. ヘッドホルダーアームの角度を調整して、カニューレを光軸に合わせます。
3. 25X 1.0 NA(開口数)、4 mm WD(作動距離)、または40X 0.8 NA、3 mm WDの水浸対物レンズに切り替えます。カニューレを満たすのに十分な脱イオン水を追加し、カニューレの上に余分な水を維持します。気泡の形成を避けてください。
4. 2光子(2P)励起と画像蛍光シグナルを使用します。
   注: イメージングプロトコルは、イメージングする時間と空間スケールに大きく依存します。この記事で示した画像の生成に使用したイメージング設定の詳細については、このセクションの代表的な結果とディスカッションを参照してください。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ステンレス鋼管 Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm	さわで	R00303	カニューレ金属リング用のステンレス鋼管
Microscope cover glass (4 mm round)	Engelbrecht Medizin and Labortechnik		カニューレガラス用のガラスカバースリップ
イソフルランCP、フラッシュ250ml	Henry Schein VET GmbH	798932	Liquid麻酔用イソフルラン
ハーバード装置イソフルラン漏斗充填気化器	Harvard Apparatus GmbH	34-1040	イソフルラン気化器
Lab Active Scavenger	Gropper Medizintechnik	UV17014	イソフルランスカベンジャーシステム
CMA 450 Temperature Controller	Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH	8003770	暖房用ブランケット
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer AG		Ophtalmic ointment
ヘッドプレート	カスタムmade		30 mm x 10 mm size; 直径 8 mm の穴、チタン<
ヘッドプレートクランプ	カスタムメイド
台座のポストホルダー	Thorlabs	PH20E/M	ヘッドプレートホルダー
ステンレス製ポスト	Thorlabs	TR30/M	ヘッドプレートホルダー
ステンレス製ポスト	Thorlabs	TR75/M	ヘッドプレートホルダー
ステンレス製ポスト	Thorlabs	TR150/M	ヘッドプレートホルダー
ポストコネクタークランプ	カスタムメイド		ヘッドプレートホルダー
アルミニウムブレッドボード、300 mm x 450 mm x 12.7 mm、M6 Taps	Thorlabs	MB3045/M	顕微鏡ステージ
7" x 4" ラボジャック	Thorlabs	L490/M	顕微鏡ステージ
ロープロファイルフェイスマスクスモールマウス	Emka Technologies	VetFlo-0801	麻酔フェイスマスクホルダー
パワーメーターモデル 1918-R	Newport		パワーメーター
X-Cite 120Q	Excelitas Technologies		蛍光ランプ
二光子顕微鏡	Bruker	Ultima IV	二光子顕微鏡
二光子顕微鏡	Thorlabs	Bergamo	二光子顕微鏡
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22	Olympus		Objectives
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22	Olympus		Objectives
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5	Olympus		Objectives
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18	Olympus		Objectives
2P励起のためのUltafastチューナブルレーザー	Spectraphysics	MaiTai Deep See	励起レーザー
2P励起用のUltafastチューナブルレーザー	Spectraphysics	InSight DS+ デュアルビーム	励起レーザー
3P励起のためのUltafastチューナブルレーザー	Coherent	モナコ	興奮レーザー

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