このビデオは、蛍光顕微鏡を使用して硬膜の感覚ニューロンの起源を追跡する方法を示しています。逆行性トレーサーを麻酔ラットの露出した硬膜に導入します。トレーサーは感覚ニューロン軸索に取り込まれ、三叉神経節と頸部後根神経節内の細胞体に逆行性に移動します。次に、神経節を切片化し、細胞体内のトレーサーと神経ペプチドを標識する抗体で染色し、蛍光顕微鏡を使用して分析して、感覚ニューロンの神経節の起源を確認します。
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方法論記事
蛍光顕微鏡を用いた硬膜細胞の感覚ニューロンの起源の調査
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2025年5月29日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医によってレビューされています。レビューボード。
1. フルオロゴールド（FG））
- 手術
- ラット頭蓋硬膜の関心のある座標領域を決定します。
- 10μLのマイクロシリンジを調製し、流動パラフィンで試験します。
- 腹腔内注射により、ラットをトリブロモエタノール溶液(150 mg / kg)で麻酔します。.つま先のつま先をつまむことに反応しないことで、麻酔の深さを確認してください。
- 電気カミソリでネズミの頭を剃ります。
- ラットに鈍いイヤーバーを装着し、定位固定装置の上に置きます。次に、マウスホルダーを置き、眼科用軟膏を目に塗ります。
- 10%ポビドンヨードと75%エタノールを使用して、頭部皮膚の手術部位を洗浄します。
- 頭皮の正中線に沿って切開します。
- 滅菌した綿の先端のアプリケーターを使用して、頭蓋骨から骨膜と筋肉組織を鈍く取り除きます（<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>図1A).
- 中髄動脈(MMA)の上の左頭頂骨と側頭骨に丸い先端のビット(#106)を備えたバリドリルを使用して小さな穴(~5-7 mm)を開け、頭蓋硬膜が無傷で保たれていることを確認します（図1B).
- トレーサーの拡散を制限するために、穴の周りに歯科用ケイ酸塩セメントで土手を作ります（図1C).
- 10μLのマイクロシリンジでMMAの周りの穴に2μLの2%FGを2<追加します（span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Figure 1D)。
- 止血スポンジの小片で穴を覆います。
- 穴にパラフィンフィルムを貼り、端を骨ワックスでシールして、トレーサーの漏れを防ぎ、周囲の組織を汚染しないようにします。
- 滅菌糸で傷口を縫合します。
- ラットが完全に回復するまで、ネズミを暖かい場所に保管してください。
- ラットをケージに戻し、飲料水に抗生物質と鎮痛剤を追加します。
- 灌流とセクション
- 7日間の生存後、これらのネズミを灌流してください。
- 三叉神経節(TG)とC1-4後根神経節(DRG)を解剖し、それらをポストフィックスして凍結保護します（（図1F).
- TGとDRGをクライオスタットミクロトームシステム上で30μmの厚さで矢状方向に切断し、シランコーティングされたスライドガラスに取り付けます。
- TGおよびDRGsにおけるFGおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)標識の二重免疫蛍光<br />注: FGラベリングは、追加の染色なしで水銀ランプ下の紫外線(UV)照明で直接観察することができますが、FGで標識されたニューロンは、硬膜CGRP免疫反応性の起源を明らかにするために、FGとCGRPによる二重免疫蛍光法を使用してTGおよび頸部DRGでさらに調べられましたTGおよびDRGの神経線維。
- histochemical ペンでセクションを丸で囲みます。
- 0.1 M リン酸緩衝液(PB)に 3% の正常ロバ血清と 0.5% Triton X-100 を含むブロッキング溶液で切片を 30 分間インキュベートします。
- サンプルを、1%正常ロバ血清と0.5%Triton X-100を含む0.1 M PB中のウサギ抗フルオロゴールド(1:1000)およびマウス抗CGRP抗体(1:1000)の溶液に4°Cで一晩移します。
- 翌日、切片を0.1 M PBで3回洗浄します。
- ロバ抗ウサギAlexa Fluor 594(1:500)とロバ抗マウスAlexa Fluor 488(1:500)二次抗体の混合溶液で、1%正常ロバ血清と0.5%Triton X-100を含む0.1 M PB溶液で室温で1.5時間インキュベートします。
- 洗ってカバースリップをセクションに貼り付けます。
- 観察と記録
- デジタルカメラを装備した蛍光顕微鏡で、TGおよびDRGのFG標識ニューロンの画像を撮影してください。
- デジタルカメラを搭載した蛍光顕微鏡で、TGおよびDRGのFGおよびCGRP標識ニューロンの画像を撮影します。
- 編集ソフトウェアを使用して、画像の明るさとコントラストを調整し、画像にラベルを追加します。
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結果
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 ロバ抗マウスIgG (H+L) | |||
| Brain stereotaxis instrument | |||
| CellSens Dimension | |||
| フルオロゴールド(FG) | |||
| Fluorescent imaging system | |||
| 凍結ミクロトーム | |||
| Micro Drill | |||
| マウス反CGRP | |||
| Normal donkey serum | |||
| Phalloidin568 | |||
| Photoshopとイラスト | |||
| Rabbit anti- Fluorogold | |||
| Sprague Dawley | |||
| Superfrost plus microscope slides |
