共焦点顕微鏡法を用いたゼブラフィッシュにおけるレーザーアブレーションニューロマスト間細胞の回収率のモニタリング

要約

出典: Volpe, B. A., 他 ゼブラフィッシュ神経マスト細胞における共焦点顕微鏡ベースのレーザーアブレーションおよび再生アッセイ. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュのニューロマスト間細胞の回復のモニタリング、タイムラプス蛍光イメージングによる細胞死と修復の追跡を実演しています。

プロトコル

1. 再生を研究するためのアブレーション後のイメージングとタイムラプス顕微鏡

1. "チャンネル".チャンネルで、"DAPI"(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)トラックを使用して、アブレーションレーザーを不活性化します。「Acquisition mode」のドロップダウンメニューをクリックしてください。
2. 取得モードで、「Zoom」をクリックしてください。
3. スライダーを使用するか、「0.7."
   1. セルアブレーションを成功させるために、ゲインを900に増やし、視野を高速にスキャンしてください。
      NOTE: 標的細胞内にGFP(緑色蛍光タンパク質)が見られないこと。アブレーション前の画像と同じまたは類似の設定を使用して、アブレーション後の画像をキャプチャして保存します（ <span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Figure 1C).画像に蛍光細胞の残骸や除去が必要な追加の細胞体が明らかな場合は、レーザーアブレーションの手順を繰り返して、一連のインターニューロマスト細胞に目に見えるギャップを作成します。
   2. T-PMT(Transmission Photomultiplier Tube)チャネル像を検査し、細胞の損傷をさらに確認します。損傷した細胞は粒状の外観を持ち、核は頻繁に膨らんだり、形が不規則になったりします（<span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'図2).
4. アブレーション前の画像をキャプチャし、必要に応じて細胞をアブレーションし、個々のステージ位置ごとにアブレーション後の画像をキャプチャした後、画像キャプチャのステージ位置と時間オプションの両方をアクティブにして、タイムラプス顕微鏡をセットアップします。時間パラメータを 24 時間または別の目的のエンドポイントと 15 分間隔に設定します。実験を開始して画像を取得し、完了したら(翌日)結果のファイルを保存します。
5. 幼虫をさらに研究または飼育する場合は、細い鉗子を使用して幼虫をアガロースから慎重に取り除き、トリカインを含まないE3培地に移して回収します。それらをさらに使用しない場合は、承認された動物プロトコルに従って安楽死させ(氷浴に迅速かつ持続的に浸すことが一般的な方法です)、施設の要求に応じてそれらを処分します。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12-well PTFE Printed Slides	Electron Microscopy Sciences	63425-05
15 mM Tricaine stock solution	Sigma	E10521	15 mM Tricaine in reverse osmosis water
1X E3 + 600 μM Tricaine		1X E3メディアで15 mMのTricaineストックを25倍に希釈します
1X E3 media			60X E3 mediaを逆浸透水(16.7 ml/L)で1倍に希釈してください。
60 X E3 media	Sigma-Aldrichから購入したすべてのコンポーネント		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water
Bx60 水銀アークランプ蛍光の複合顕微鏡	Olympus
LSM 700 共焦点顕微鏡、405 nm、488 nm、555 nmまたは561 nmのレーザーを装備	Carl Zeiss Microscopy, LLC		アブレーションには5mWの405nmレーザーを使用しました。アブレーションとイメージングは、NAが1.40
FIJI/ImageJ 画像処理ソフトウェア	複数の貢献者
解剖針をヘアナイフに改造<	19010	まつげが木の柄の解剖針の端に接着されました
Microsoft Excel software	Microsoft Corp.		Google sheetsはMicrosoft Excelの無料代替品です
ガラス底35mm皿、No.1.5カバースリップ、20mm窓	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm シャーレ、20 mm ガラス窓
Immersol 518F Immersion Oil	フィッシャーサイエンティフィ	12-624-66A
Low Gelling Agarose	Sigma Life Science(シグマライフサイエンス	A9414-256
Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		ダウンロード可能 https://rstudio.com/
SMX-168-BL 実体顕微鏡	Motic
Transfer Pipette	フィッシャーサイエンティフィ	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC

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