マウス大腸筋神経叢における腸内ニューロンとグリア活性のカルシウムイメージング

要約

出典:Fried, D. E., Gulbransen, B. D.In Situ Ca²⁺ 腸神経系のイメージング J. Vis. Exp. (2015)

}このビデオはカルシウムを示していますマウス結腸筋神経叢調製物における腸管ニューロンとグリアの活動を視覚化および分析するためのイメージング。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.Modified Krebs bufferを準備します。

成分の最終濃度(mM単位)が121 NaCl、5.9 KCl、2.5 CaCl₂、1.2 MgCl₂、1.2 NaH₂PO₄、10 HEPES、21.2 NaHCO₃、1 ピルビン酸と 8 グルコース (NaOH で pH を 7.4 に調整)。3 μM のニカルジピンと 1 μM のスコポラミンを添加して、Ca ²⁺ イメージングおよびホールマウント解剖中の筋収縮を抑制します。

2. イメージングと解析

注: 蛍光光源、顕微鏡、高品質のCCDカメラ、適切な取得ソフトウェアを備えた基本的なイメージングリグを少なくとも使用してください。他のコンポーネントの追加は、光源や特定のアプリケーションによって異なります。フィルターホイールとシャッターは、従来のキセノンアーク光源と一緒に使用する必要があります。しかし、LED光源や照明システムには、これらの部品は必要ありません。

1. 記録チャンバーを顕微鏡下に配置し、複数の加熱シリンジリザーバーを備えた重力流灌流システムを使用して、37°Cクレブス緩衝液の2〜3 mL/分の連続灌流速度を確立します。バキュームトラップに接続された入力ラインと吸引ラインの両方で気泡が形成されないようにしてください。
2. 明視野照明下で目的の神経叢に焦点を合わせます。光退色につながる可能性のある組織を過度に露出しないようにしてください。
3. 神経節内のFluo-4負荷を調べ、イメージングのために健康な神経節を選択します。不健康/損傷した神経節は、自家蛍光または点状の形態を示すため、イメージングには使用しないでください。
4. 神経節を選択したら、光路をカメラに向け、画像取得ソフトウェアでライブ画像を取得します。神経節にピントが合っていることを確認し、画像取得速度と露光時間を設定します。
   注: 画像の取得速度と時間は、調査員が記録したいイベントによって異なります。ほとんどの実験では、従来、グリア細胞では0.5-1 Hz、ニューロンでは最大2-1 Hzで画像が取得されます。これは、グリアCa²⁺の応答がCa²⁺ のトランジェントほど速くないためです。
5. 実験を開始し、30秒間のベースライン活動を確立します。
6. 重力流灌流システムを使用して、受容体アゴニストやアンタゴニストなどの事前に温めた目的の薬物を2〜3 ml / minの速度で適用します。アゴニスト/アンタゴニストの適用後、正常な緩衝液の灌流に戻り、少なくとも10分間の洗浄/回復期間を確保します。
   注: 薬物適用時間は、個々の化合物と実験デザインによって異なります。一般に、アゴニストの20〜30秒の塗布は、ニューロンおよびグリア細胞のGタンパク質共役受容体を活性化するのに十分である。しかし、リガンド依存性イオンチャネル(ニコチン性アセチルコリン受容体など)は、5〜10秒以内のアプリケーション時間を必要とします。さらに長時間のばく露により、リガンド依存性イオンチャネルが急速に脱感作されます。アンタゴニストは、受容体経路の完全な遮断を確実にするために、約3〜15分間適用する必要があります。.しかし、これは大雑把な一般化であり、研究者は常に実験薬を自分の特定のパラダイムで最適化する必要があります。
7. 実験の録画を停止し、タイムラプス動画で視聴します。適切な画像解析ソフトウェアを使用して、関心領域(ROI)を慎重に選択します。
8. ソフトウェアを使用して、ROI蛍光強度を初期ベースライン蛍光値に対して正規化し、比較します。正規化された蛍光の変化は、[Ca²⁺]の変化に正比例します。
   1. ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)バックグラウンド(F1は任意の点での蛍光、F0はベースライン蛍光)を使用して前述の方法の修正を使用して、評価精度を向上させます。この修飾は、筋腸神経叢の下にある筋肉層の動きを示す組織調製物の蛍光変化によるノイズを低減するのに役立ちます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Fluo-4 AM dye	Invitrogen	F-14201
Glucose	Sigma	G8270
昆虫ピン<	minutien Pins
iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
塩化カリウム	Sigma	P3911
塩化マグネシウム	Sigma	M9272
塩化ナトリウム	Sigma	S9888
リン酸二水素ナトリウム	Sigma	S8282
重炭酸ナトリウム	Sigma	S6014
Neo sCMOS camera	Andor	Neo 5.5 sCMOS
Nicardipine	Sigma	N7510
蠕動運動	Harvard Apparatus	Model 720
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Probenecid	Molecularプローブ	P36400
Scopolamine	Sigma	S1013
Sutter Lambda DG-4	Sutter	DG-4
Sylgard	Dow Corning	184
Temperature Controller	ワーナーインスツルメンツ	TC-344C

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