固定マウス脳スライスにおける蛍光色素イオントフォレーシスを用いたアストロサイト形態の可視化

要約

出典:Moye, S. L., et.al.Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、蛍光色素イオントフォレーシスを使用して、固定脳スライスのアストロサイトの形態を研究する方法を示します。これは、低電圧電流の下で陰イオン性の親水性色素を細胞質に送達するための電極によるアストロサイト体細胞の穿孔を詳述し、色素が体細胞と枝を拡散して標識することを可能にします。次に、共焦点顕微鏡を使用して標識されたアストロサイトを視覚化し、形態学的な洞察を提供します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.イオントフォレーシスによるアストロサイトの充填

1. 電極をテストします。
   1. 0.1 M PBSを充填したガラス底の皿に、室温で脳のスライスをそっと入れます。プラチナハープとナイロン弦でスライスを所定の位置に保持します。
   2. 電極が電圧源に接続されていることを確認し、接地電極をブレインスライスを含む浴に入れます。
   3. 目標を関心のある脳の領域に移動します。
   4. 電極を溶液に下げます。明視野の下で、視野の中央に移動し、40倍水浸レンズで慎重に調べて、透明で破片や気泡がないことを確認します。電極先端に何か詰まっているものがある場合は、新しいものと交換してください。
      注: 目詰まりは200MΩの電極にとって懸念事項です。毎回の実験の前に色素溶液を遠心分離してろ過することで、これは頻繁に問題になることはありません。しかし、電極の先端が小さいため、開口部に組織が詰まってしまうことがあります。著者らはこれを防ぐ方法を見つけていませんが、新しい電極を使用するだけで簡単に対処できます。
   5. 明視野の下で、電極をスライスに向かってゆっくりと下げ、表面のすぐ上で停止します。
2. アストロサイトをイオントフォレーシスで満たします。
   1. スライス表面から40-50 μm下にあるアストロサイトを、赤外線微分干渉コントラスト(IR-DIC)で同定します。直径約10μmの細長い楕円形の体細胞を探します。アストロサイトを選択したら、視野の中心に移動します。
      注: イオントフォレーシスに適した細胞は、周囲に明確で定義された境界を持っています。スライスの表面に近すぎるセルは、完全に塗りつぶすことができないため、選択しないでください。染料充填用のアストロサイトを日常的に識別できるようになるには、数日かけてある程度の練習が必要です。実験に用いる脳の領域によって、アストロサイトの数は異なります。これは、充填前にアストロサイトを特定するのに必要な時間に影響を与える可能性があります。
   2. 電極の先端をゆっくりとスライスに下げ、組織内を移動しながら、細胞体と同じ平面上に来るまで待ちます。
      注: 組織を傷つけないように電極をゆっくりと動かします。
   3. アストロサイトの細胞体がはっきりと見え、輪郭が描かれたら、電極をゆっくりとゆっくりと前方に進めます。先端が細胞の体細胞を突き刺すまで電極を動かします。対物レンズの焦点をゆっくりと上下に動かして、電極が体細胞の内側にあるかどうかを確認します。
      注: 電極の先端は細胞体の内側にある必要があり、体細胞に小さなくぼみが観察される必要があります。先端がセルを通過するのを避けるために、電極をこれ以上動かさないでください。
   4. 電極の先端がセル内に入ったら、~0.5-1 Vで刺激装置をオンにし、セルに電流を連続的に放出します。共焦点顕微鏡を使用して、細胞の充填を観察します。デジタルズームを上げてセルの詳細を表示し、電極の先端がセル内に見えることを確認します。
      注: 細胞から色素が漏れ出しているか、近くの他の細胞を満たしているように見える場合は、電圧を下げてください。まだ細胞から色素が漏れているように見える場合は、電極をゆっくりと引き出して、別の細胞を見つけます。染料が漏れないことは、最終画像で高いシグナル/バックグラウンド比を持つために重要です。
   5. より細かい分岐とプロセスが明確になるまで約15分間待ち、電圧をオフにして、電極先端をセルから静かに引き抜きます。
3. 塗りつぶされたセルをイメージ化します。
   注: 充填後すぐにイメージングを行うことができます。開口数(NA)が高い対物レンズは、解像度が高くなります。
   1. 細胞が元の形に戻るまで待ってから、40倍の対物レンズでイメージング(15〜20分)します。セルをイメージングするには、共焦点の設定を調整して、より細かい分岐とプロセスが明確に見えることを確認します。
   2. 0.3 μm のステップ サイズで z スタックを設定します。イメージング中に、セルからの信号がなくなるまで対物レンズを動かし、それを上部に設定します。次に、信号がなくなるまで対物レンズを下に移動させ(セルを通して焦点を合わせ)、それを下部に設定します。

材料