Source: Sabado, V., et al., 名越、E. 単一セル解像度蛍光ライブイメージング ショウジョウバエ 幼虫の脳文化における概日時計。 J. Vis. Exp. (2018).
このビデオは、 ショウジョウバエし、その後、概日時計ニューロンのタイムラプス蛍光イメージングを行い、明暗サイクルと同期したリズミカルな活動を分析します。
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方法論記事
ショウジョウバエの脳をマトリックスに埋め込むことで、概日時計ニューロンのタイムラプスイメージングが可能
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2025年5月29日
この記事について
要約
プロトコル
- 脳外植片の3Dマトリックスへの埋め込みとマウント(~20分)。
- 次のように、解剖した脳をフィブリノーゲンワーキング溶液(フィブリノーゲン最終濃度~3.3 mg / mL、脳あたり10.5 μL)に浸します:
- シュナイダー活性培地(SAM)/抗生物質3.5μLを吸引します。.解剖した脳を解剖ウェルから同じピペットチップに吸引し、チップにSAM /抗生物質培地を分注せずにします。
- 滅菌ペトリ皿の蓋に脳と培地を分配します。さらに3.5μLのSAM/抗生物質と3.5μLの温かいフィブリノーゲン/SAM 10 mg/mL溶液を脳を含む滴に加えます。.20 μLのピペットチップでピペッティングして、脳の周りで溶液を穏やかに混合します。
注: このステップで鉗子ではなくピペットを使用すると、脳へのストレスを回避できます。 - 滴下液から2μLのフィブリノーゲンワーキング溶液を取り出し、ガラス底皿のカバーガラスに小さな円として塗布します。0.8 μLのトロンビンを加え、ピペットチップで非常に迅速に混合します。フィブリノーゲンはフィブリンに変換され、重合を開始します。
- フィブリノーゲンワーキングソリューション(ステップ1.1)にある脳を、一対の鉗子の間に置き、フィブリンの白いマトリックスが見えたらマトリックス上に配置します。脳の前面を下に向けています(時計ニューロンのイメージング用)。カバーガラスにできるだけ近づけて押し下げます。フィブリン血栓は、フィブリンの層で構成されています。1つのレイヤーを選択し、マトリックスを取り外すことなく、小さくて穏やかな動きで脳の上に折ります。
- 血栓のさまざまな部分から2〜3回繰り返して、脳を安定させます。
注: 鉗子で脳を取り扱うときは、脳を乾燥させたり、身体的なストレスをかけたりしないように注意してください。
- 血栓のさまざまな部分から2〜3回繰り返して、脳を安定させます。
- 埋め込まれた脳の上に20μLのSAM/抗生物質を加えて、トロンビンの作用を止めます。
- この手順を繰り返して、残りの頭脳をマウントします。ガラス底の皿に最大5〜6個の脳を埋め込むことができます。
- 長期のライブイメージングを行うには、インナーウェル(ガラス部分)に600μLのSAM/抗生物質を加えます。メディウムの上にプレカットされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレンを配置し、底のプラスチック部分に塗布された真空グリースに貼り付けます(図1A)。
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結果
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | 彼らが研究室にあるものとまったく同じかどうかはわかりません。私は可能な限り「昆虫細胞培養に適した」を選択しました | ||
| CaCl2 | |||
| MgSO4.7H2O | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| D-(+) Glucose | |||
| 酵母抽出 | |||
| Insulin | |||
| Penicillin-Streptomycin | |||
| BIS-TRIS | |||
| L-(−)-リンゴ酸 | |||
| D-(+)-トレハロース二水和物 | |||
| コハク酸 | |||
| フマル酸 | |||
| α-ケトグルタル酸 | |||
| 非熱不活性化、胎児子牛血清(FCS)マイコプラズマおよびウイルススクリーニング済み | |||
| HEPES-KOH, pH 7.4 | |||
| KCl | |||
| NaH2PO4 | |||
| Sucrose | |||
| ウシ血漿からのフィブリノーゲン | 注意:吸入、皮膚との接触、および飲み込むと有害です。層流下で操作 | ||
| ウシプラズマからのトロンビン | Sigma-Aldrich | ||
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | ||
| Vacuum grease | |||
| 35 mm 皿、No. 1.5 カバースリップ、ガラス径 20 mm、コーティングなし | MatTek | ||
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | |||
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm スレッドボトルトップフィルター、0.22 μm | |||
| ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)フィルム | |||
| Millex-HV シリンジフィルターユニット, 0.45 μm, PVDF, 33 mm, ガンマ滅菌済み | |||
| Millex-GV シリンジフィルターユニット, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, ガンマ線滅菌済み | |||
| 3ウェルガラス解剖皿 | |||
| Fine Forceps, size 5, Dumont | |||
| タンデムスキャナ反転TCS SP5共焦点顕微鏡、共振スキャナとHyD光電子増倍器 | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| 温度制御チャンバー | キューブ&ボックス温度制御システム、カスタムデザイン | ||
| -stage-top 湿度コントローラー | |||
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack作成と3D補正ドリフトプラグイン | |||
| 10x 反復デコンボリューション | AutoQuant と Imaris ソフトウェア |
