マウス胚由来の腹側中脳ニューロンにおけるカルシウム流入の可視化

要約

Source: バンクロフト、E. A., et al.自発的なCa style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'²⁺ > Fluxes and their downstream effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、マウス胚由来の腹側中脳ニューロンにおけるカルシウム流入のリアルタイム可視化を示しています。カルシウムインジケーターを発現させるウイルスベクターを用いて、ニューロンを共焦点顕微鏡でイメージングし、自発的および神経伝達物質によって誘発されるカルシウム活性中の蛍光強度の変化を追跡します。

プロトコル

1.細胞のめっき<

span style='background-color:transparent;color:#000000;'注：経験に基づいて、胚ごとに約100,000個の生存細胞が収集されます。生後2〜3ヶ月の時限妊娠マウスは、通常、8〜10個の胚の同腹児数を持っています。したがって、妊娠したマウス1匹あたりの細胞の総収量の概算は約100万個です。

1. 血球計算盤を使用して細胞数を測定し、細胞培養培地を使用して懸濁液を2,000細胞/μLに希釈します。短く三つ折りにして混ぜます。
2. インキュベーターからラミニン溶液の入ったカバースリップを取り出し、コーティングされたカバースリップから残りのラミニン溶液を真空で吸引します。カバースリップが完全に乾かないように、すばやくプレートします。各カバースリップに100 μL(2.0 x 10⁵細胞/カバースリップ)をピペットで移し、ペトリ皿を37°Cのインキュベーターに1時間入れます。
3. 各ディッシュに3mLの細胞培養培地を慎重に加え、37°Cのインキュベーターに戻します。プリフォームの半分の培地交換を週に2回、2週間行います。

2. アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター

1. による14（in vitro)DIVでの細胞培養の感染各ディッシュに対して、1 mLの無血清DMEM培地と1 μLのhSyn-GCaMP6f AAV（1.0 x^{10 13} titer）を準備します<
2. span style='background-color:transparent;色:#000000;'>各ディッシュから細胞培養培地を吸引し、hSyn-GCaMP6fを含む無血清のダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)1 mLと交換します。ディッシュを37°Cのインキュベーターに1時間戻します。
3. AAVを含む無血清培地を吸引し、3mLの細胞培養培地と交換してください。ディッシュを37°Cインキュベーターに戻します。5〜7日間のAAV感染により、理想的なレベルのGCaMP発現が得られることがわかりました。このウイルス感染期間中は、2〜3日ごとに培地を交換し続けます。

3. in vitro (DIV)で19-21日間の共焦点Ca²⁺ライブイメージング

注:イメージングはウイルス感染後5-7日の間に行うことができます。これは、自発的なCa²⁺活性の検出を可能にするレベルで蛍光色素の目に見える発現を達成するための理想的なウィンドウです。

1. 記録バッファーの準備
   1. HEPES記録バッファー1Lを作るには、9.009 gのNaCl、0.3728 gのKCl、0.901 gのD-グルコース、2.381 gの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2 mLの1 M CaCl₂ストック溶液、および500 μLの1 M MgCl₂ストック溶液を800 mLの滅菌蒸留H₂に追加します。O. NaOHでpHを7.4にします。最終容量を1 Lにします。
   2. 200 mLの20 μMグルタミン酸記録バッファーを作成するには、40 μLの100 mMグルタミン酸ストック溶液を上記の200 mLのHEPES記録バッファーに希釈します。
2. 共焦点イメージング
   1. 滅菌済みの35mmシャーレに3mLの記録バッファーを入れます。
   2. 37°Cのインキュベーターから感染した培養物が入った35mmのシャーレを取り出します。細い先端鉗子を使用して、片方のカバースリップの端を慎重につかみ、記録バッファーで満たされたペトリ皿にすばやく移します。残りのカバーガラスを中温にして37°Cインキュベーターに戻します。記録バッファーを装着したディッシュを共焦点顕微鏡に搬送します。
   3. イメージングソフトウェアを起動します。初期化中に次の手順に進みます。
   4. 蠕動ポンプを開始し、記録バッファにラインを配置します。流量を2 mL/minに校正します。
   5. 感染したカバースリップを35mmシャーレから記録槽に移します。
   6. 10倍の水浸対物レンズと明視野(BF)ライトを使用して、焦点面を見つけ、ニューロン細胞体が高密度の領域を探します。40倍水浸対物レンズに切り替え、BFライトを使用してサンプルの焦点を合わせ直します。
   7. FluoView内の「染料リスト」ウィンドウで、AlexaFluor 488を選択し、適用してください。
   8. AAV表現は可変にすることができます。したがって、蛍光色素の露出過多と光退色を防ぐためには、低いHVとレーザー出力の設定から始めてください。AlexaFluor 488チャンネルでは、高電圧(HV)を500、ゲインを1x、オフセットを0に設定します。488レーザーラインの場合、出力を5%に設定します。z平面で画像化された有効体積を増やすには、ピンホールサイズを300μmに増やします。「フォーカスx2」スキャンオプションを使用して、発光信号をサブサチュレーションレベルに最適に調整します。ここから、各チャンネルの理想的な視認性が得られるまで設定を調整できます。
      注：GCaMPで^Ca2+フラックスの全範囲を正確に捉えるには、検出器を過飽和にすることなく蛍光強度を増加させることができるように、ベースラインHVとレーザー出力の設定を調整してください。
   9. 顕微鏡の設定が最適化されたら、GCaMP6f蛍光の自発的な変化を示す複数の細胞がある領域を見つけるためにステージを移動させ、イメージングのために目的の平面に焦点を合わせてください。
   10. 「Clip rect」ツールを使用して、イメージングフレームを1秒未満のフレーム間隔を達成できるサイズにクリップします。これは、イメージング間隔を1フレーム/秒に設定するために必要です。
   11. 「Interval」ウィンドウを1.0に、「Num」ウィンドウを600に設定します。
       注:所望の時点(300秒)で異なる記録バッファを配信するためには、新しい溶液をバスに供給するためのポンプの遅延を調整することが重要です。これは、溶液の灌流速度(2 mL/分)と、溶液のポンピングに使用するラインの長さによって異なります。
   12. tシリーズのムービーをキャプチャするには、「Time」オプションを選択し、「XYt」スキャンオプションを使用してイメージングを開始してください。
   13. イメージングプログレスバーを見て、適切な時点でHEPES記録バッファから20μMグルタミン酸記録バッファにラインを移動します（例えば、ポンプのレイテンシが60秒で溶液を送達するように調整されている場合、300秒でグルタミン酸を送達するためには、240フレームでラインをグルタミン酸バッファーに移動させます)。
   14. イメージングが完了したら、Series Doneボタンを選択し、完成したtシリーズムービーを保存してください。20 μM グルタミン酸をさらに 5 分間灌流し続け、培養ニューロンをグルタミン酸に合計 10 分間曝露します。イメージ化するカバースリップごとにこのプロセスを繰り返します。
   15. 20μMグルタミン酸への追加の5分間の曝露の後、浴槽からカバースリップを取り出し、イメージングの日が完了するまで記録バッファーを含む35mmのペトリ皿に戻します。

材料