免疫標識およびクルクミン染色による脳組織切片のアミロイドβプラークのイメージング

要約

出典: Maiti, P. et.al.,.天然ポリフェノールクルクミンを使用した脳組織におけるアミロイドプラークの標識とイメージング J. Vis. Exp. (2019)

}このビデオは、免疫標識とクルクミン染色を使用した脳組織切片のアミロイドβプラークのイメージング手順を示しています。免疫標識はアミロイドβに特異性を付与し、クルクミンはβシートリッチなフィブリルに選択的に結合し、可視化を強化します。赤色と緑色の蛍光の共局在は、プラークの存在を確認します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.動物の灌流

1. 固定液と灌流バッファーを準備します。
   1. 塩化ナトリウム(NaCl)80 g、塩化カリウム(KCl)2 g、リン酸水素二ナトリウム(Na₂HPO₄・7H₂O)、 リン酸二水素カリウム (KH₂PO₄) と 2 L の合計 1 L.
   2. を調製します。
      1. 1 Lのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(0.1 M、pH 7.4)に40 gのパラホルムアルデヒドを加えます。
      2. PFA溶液を60−65°Cに加熱し、マグネチックスターラーを用いて混合します。
         注: 温度は65°Cを超えないようにしてください。
      3. スポイトで水酸化ナトリウム(NaOH)(1 N)を数滴加えて、PFAを完全に溶解します。
      4. PFA溶液を中程度から細かい濾紙でろ過し、4°Cで保存します。
         注: 溶液は1ヶ月間有効です。
2. 動物の麻酔と灌流を行います。
   注: 生後12ヶ月のB6SJL-Tg APP SwFlLon、PSEN1*M146L*L286V、1136799Vas/J ( 5x 家族性アルツハイマー病 （5×FAD)) 年齢一致対照マウス (n = 6 グループあたり) をベンダーから購入し、サギノーバレー州立大学の動物館で飼育しました。ジェノタイピングは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって確認されました。ヒトのアルツハイマー病(AD)の脳組織には、死後ADの脳組織と年齢が一致した対照組織が含まれます。
   1. ペントバルビタールナトリウム(390 mg / kg体重)、またはケタミン/キシラジン混合物(最大80 mg / kg体重ケタミンと10 mg / kg体重キシラジン)などの適切な麻酔薬で動物を腹腔内注射(27 G針と1 mL注射器)で麻酔します。.つま先をつまんで麻酔のレベルを確認します。動物が反応しない場合は、灌流手術の準備ができています。
   2. 麻酔した動物を灌流手術トレイの仰臥位に置き、小さな虹彩はさみを使用して、左心室の後端を切開します。
   3. 22Gの灌流針を左心室に挿入し、右耳介に小さな切開をして体から灌流液を取り除きます。重力供給灌流システムを使用して、氷冷灌流液(0.1 M PBS、pH 7.4)を5-6分間(流速20-25 ml / min)流します。
      注: 透明な肝臓は最適な灌流の指標です。
   4. バッファーバルブを氷冷した4%パラホルムアルデヒド溶液に切り替えて固定し、8−10分間流します。
      注: 振戦に続いて手足が硬化または硬くなるのは、良好な固定の指標です。
   5. ハサミを使って頭蓋骨から脳を取り出します。スパチュラを使用して脳を採取し、4% PFA(脳の体積の少なくとも10倍)のバイアルに入れ、さらに使用するまで4°Cで保存します。

2. 組織処理

1. クライオスタット切片を切断します。
   1. 脳を等級付きショ糖溶液(10%、20%、および30%)に移し、使用するまで4°Cでそれぞれ24時間保存します。
   2. -22°Cのクライオスタットを使用して、厚さ40μmの切片を切断します。PBSとアジ化ナトリウム(0.02%)を充填した6ウェルプレートに、ウェルあたり10−20切片を回収します。

3. cur(クルクミン){{}}をAβプラークおよびオリゴマー中のAβ抗体と共局在させます。

1. ステップ2.1.2のクライオスタット切片をPBS 3xで12ウェルプレートで洗浄します。
2. 室温で1時間、0.5% Triton-X-100と共にPBSに溶解した10%正常ヤギ血清(NGS)で切片をブロックします。
3. ブロッキング溶液を廃棄します。アミロイドベータ(Aβ)特異的抗体(6E10またはA11、希釈1:200)を10% NGSおよび0.5% Triton-X100を含む新鮮なブロッキング溶液に溶解した切片を、150 rpmのシェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。
4. 抗体溶液を廃棄し、切片をPBSで3回、各10分間洗浄します。
5. 赤色蛍光色素(例:Alexa
6. 594)と二次抗体タグを室温で1時間暗所でインキュベートします。
7. PBSで3回、各10分間洗浄します。
8. 70%アルコールで1x.
9. で切片をクルクミン(Cur(10μM))と室温で5分間インキュベートします。
10. 70%アルコールで3回、各1分間洗浄します。
11. 90%アルコールと100%アルコールで各1分間脱水し、キシレン2xで各5分間透明にし、ジスチレン可塑剤キシレン(DPX)を使用してスライドにマウントします。
12. 蛍光顕微鏡と、赤信号と緑信号に適した励起/発光フィルターを使用して視覚化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アルツハイマー病の動物モデル	ジャクソンの研究室、バーハーバー、ME
絶対アルコール	VWR,Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX
Antibody 6E10	Biolegend, San Diego, CA
Antibody A11	マサチューセッツ州バーリントン
Cryostat	GMI,ミネソタ州ラムゼイ<
Curcumin	Sigma,ミズーリ州セントルイス
リン酸水素二ナトリウム	Sigma, St. Louis, MO
ジスチレン可塑剤キシレン	BDH, Dawsonville, GA
Filter papers	Fisher scientific, Pittsburgh, PA
倒立蛍光顕微鏡	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
反転蛍光顕微鏡	オリンパス、新宿、日本	Olympus 1x70
Normal goat serum	Sigma, St. Louis, MO
パラホルムアルデヒド	Sigma, St. Louis, MO	<
塩化カリウム	Sigma, St. Louis, MO
リン酸二水素カリウム	Sigma, St. Louis, MO
アジ化ナトリウム	Sigma, St. Louis, MO
塩化ナトリウム	Sigma, St. Louis, MO	<
水酸化ナトリウム	EMD Millipore, Burlington, MA
ペントバルビタールナトリウム	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Triton-X-100	Sigma, St. Louis, MO	<
Xylene	VWR,Radnor,PA

< style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>LeicaCM1800td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>