免疫標識およびクルクミン染色による脳組織切片のアミロイドβプラークのイメージング

要約

出典: Maiti, P. et.al.,.天然ポリフェノールクルクミンを使用した脳組織におけるアミロイドプラークの標識とイメージング J. Vis. Exp. (2019)

}このビデオは、免疫標識とクルクミン染色を使用した脳組織切片のアミロイドβプラークのイメージング手順を示しています。免疫標識はアミロイドβに特異性を付与し、クルクミンはβシートリッチなフィブリルに選択的に結合し、可視化を強化します。赤色と緑色の蛍光の共局在は、プラークの存在を確認します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.動物の灌流

1. 固定液と灌流バッファーを準備します。
   1. 塩化ナトリウム(NaCl)80 g、塩化カリウム(KCl)2 g、リン酸水素二ナトリウム(Na₂HPO₄・7H₂O)、 リン酸二水素カリウム (KH₂PO₄) と 2 L の合計 1 L.
   2. を調製します。
      1. 1 Lのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(0.1 M、pH 7.4)に40 gのパラホルムアルデヒドを加えます。
      2. PFA溶液を60−65°Cに加熱し、マグネチックスターラーを用いて混合します。
         注: 温度は65°Cを超えないようにしてください。
      3. スポイトで水酸化ナトリウム(NaOH)(1 N)を数滴加えて、PFAを完全に溶解します。
      4. PFA溶液を中程度から細かい濾紙でろ過し、4°Cで保存します。
         注: 溶液は1ヶ月間有効です。
2. 動物の麻酔と灌流を行います。
   注: 生後12ヶ月のB6SJL-Tg APP SwFlLon、PSEN1*M146L*L286V、1136799Vas/J ( 5x 家族性アルツハイマー病 （5×FAD)) 年齢一致対照マウス (n = 6 グループあたり) をベンダーから購入し、サギノーバレー州立大学の動物館で飼育しました。ジェノタイピングは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって確認されました。ヒトのアルツハイマー病(AD)の脳組織には、死後ADの脳組織と年齢が一致した対照組織が含まれます。
   1. ペントバルビタールナトリウム(390 mg / kg体重)、またはケタミン/キシラジン混合物(最大80 mg / kg体重ケタミンと10 mg / kg体重キシラジン)などの適切な麻酔薬で動物を腹腔内注射(27 G針と1 mL注射器)で麻酔します。.つま先をつまんで麻酔のレベルを確認します。動物が反応しない場合は、灌流手術の準備ができています。
   2. 麻酔した動物を灌流手術トレイの仰臥位に置き、小さな虹彩はさみを使用して、左心室の後端を切開します。
   3. 22Gの灌流針を左心室に挿入し、右耳介に小さな切開をして体から灌流液を取り除きます。重力供給灌流システムを使用して、氷冷灌流液(0.1 M PBS、pH 7.4)を5-6分間(流速20-25 ml / min)流します。
      注: 透明な肝臓は最適な灌流の指標です。
   4. バッファーバルブを氷冷した4%パラホルムアルデヒド溶液に切り替えて固定し、8−10分間流します。
      注: 振戦に続いて手足が硬化または硬くなるのは、良好な固定の指標です。
   5. ハサミを使って頭蓋骨から脳を取り出します。スパチュラを使用して脳を採取し、4% PFA(脳の体積の少なくとも10倍)のバイアルに入れ、さらに使用するまで4°Cで保存します。

2. 組織処理

1. クライオスタット切片を切断します。
   1. 脳を等級付きショ糖溶液(10%、20%、および30%)に移し、使用するまで4°Cでそれぞれ24時間保存します。
   2. -22°Cのクライオスタットを使用して、厚さ40μmの切片を切断します。PBSとアジ化ナトリウム(0.02%)を充填した6ウェルプレートに、ウェルあたり10−20切片を回収します。

3. cur(クルクミン){{}}をAβプラークおよびオリゴマー中のAβ抗体と共局在させます。

1. ステップ2.1.2のクライオスタット切片をPBS 3xで12ウェルプレートで洗浄します。
2. 室温で1時間、0.5% Triton-X-100と共にPBSに溶解した10%正常ヤギ血清(NGS)で切片をブロックします。
3. ブロッキング溶液を廃棄します。アミロイドベータ(Aβ)特異的抗体(6E10またはA11、希釈1:200)を10% NGSおよび0.5% Triton-X100を含む新鮮なブロッキング溶液に溶解した切片を、150 rpmのシェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。
4. 抗体溶液を廃棄し、切片をPBSで3回、各10分間洗浄します。
5. 赤色蛍光色素(例:Alexa
6. 594)と二次抗体タグを室温で1時間暗所でインキュベートします。
7. PBSで3回、各10分間洗浄します。
8. 70%アルコールで1x.
9. で切片をクルクミン(Cur(10μM))と室温で5分間インキュベートします。
10. 70%アルコールで3回、各1分間洗浄します。
11. 90%アルコールと100%アルコールで各1分間脱水し、キシレン2xで各5分間透明にし、ジスチレン可塑剤キシレン(DPX)を使用してスライドにマウントします。
12. 蛍光顕微鏡と、赤信号と緑信号に適した励起/発光フィルターを使用して視覚化します。

材料