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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. In Vivo 二光子蛍光寿命イメージング顕微鏡
- 頭蓋窓の設置後2週間以上で、2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡(2pFLIM)イメージングを開始してください。マウスを慣れさせるために、イメージング研究の開始前にマウスを頻繁に取り扱い、首を絞めることにより、ストレスによる実験の干渉を最小限に抑えます。
- 2光子レーザーを制御するソフトウェアを使用して、2光子励起レーザーの波長を960nmに設定します。
- 4%イソフルランを使用してマウスを麻酔します。テールピンチと呼吸数の観察により、適切な麻酔を確認します。つまり、テールピンチに反応せず、呼吸数を1秒あたり~1呼吸に減らす必要があります。不必要な処置時間を最小限に抑え、麻酔が2〜3分しか続かないため、眼の潤滑剤は使用しません。
- 麻酔をかけたマウスを電動トレッドミルに移します（<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'Figure 1C)そして、マウスのヘッドプレートをトレッドミルセットアップのヘッドプレートホルダーに取り付けます（<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Figure 1 詳細については)。マウスの頭蓋窓カバースリップの表面を70%エタノールで清掃します。
- マウスを取り付けた電動トレッドミルを2pFLIM対物レンズの下に置きます。頭蓋窓のカバーガラスと対物レンズの間に蒸留水を一滴垂らします。
- 装着したマウスを麻酔から覚めさせ、少なくとも10分間トレッドミルと顕微鏡の環境に慣れさせます。装着されたマウスが麻酔から目覚めている間、マウスの呼吸数を監視します。
- 落射照明の下の射出位置に移動します。明視野下での基準特徴(すなわち、血管)を文書化して、その後のイメージングセッション中に同じ関心領域(ROI)のイメージングを支援します。
- 脳組織から放出された光以外の入射光を排除します。落射照明光源をオフにし、2pFLIMリグのエンクロージャを閉じます。ハードウェアコマンドの電圧制御をオンにして、2pFLIM PMTをアクティブにします。
- 覚醒マウスのtAKARα陽性体腫をイメージングするために、以下の推奨設定で2pFLIM取得ソフトウェアFLIMimageを使用してz-stack 2pFLIM画像を取得します。フレーム平均を3フレーム、スキャン速度を2 ms/ライン、画像サイズを128 x 128ピクセル、視野を90〜100 μmに設定します。準備とハードウェア構成に基づいてイメージング設定を調整します。
- 取得した画像をFLIMビュー(自社開発カスタムソフトウェア)で検査します。手順1.9に従ってイメージング設定を調整して、光子数を最適化し、光退色を最小限に抑えます。
注: a ROI in a tAKARα-positive soma in vivo の ROI における実行可能な統合光子数は、特定の刺激から生じる信号振幅に応じて ~1,000−10,000 光子です。
- 視野の縮小、スキャン速度の低下、レーザー出力の増加、平均化するフレーム数の増加を使用して、統合された光子数を増やし、寿命推定誤差を減らしてください。同時に、光退色を最小限に抑えるために、必要最小限のレーザー出力、フレーム平均化、およびスキャン速度を使用してください。
- ステップ1.10で決定した設定を使用してzスタック取得を繰り返すことにより、一定の時間間隔(たとえば、30〜60秒ごと)で画像化します。ベースラインの 2pFLIM 画像をゼロ トレッドミル速度で少なくとも 15 分間取得します。
- 2pFLIM画像を取得しながら、トレッドミルの回転速度を15分間~15cm/sに設定します。トレッドミルの回転をオフにした後、≥20分間イメージングを継続し、強制移動の停止後のPKA活動の持続時間を評価します。
2.2pFLIM画像の分析
1.取得した画像をFLIMviewで開き、FLIMviewで次のパラメータを設定します。
1.FLIMviewの単一光子計数(SPC)の最小範囲と最大範囲フィールドをクリックします。適切な最小SPC範囲値と最大SPC範囲値(通常はそれぞれ1.2-2〜10-12ns)を入力します。
2. tをクリックします。0 FLIMviewの値フィールドを入力し、0値 (通常は ~2 ns)。FLIMviewのライフタイム輝度最小しきい値フィールドをクリックし、5〜30光子に必要なしきい値を入力します。
2. 新しいグループボタン（N)を作成し、実験グループ名を割り当てます。これにより、追加された各FLIM画像のデータを組み合わせたグループが生成されます。
3. をクリックします。 ROIボタン Roi Controls、tAKARα陽性体細胞の周囲にROIを描画します。zスタックの範囲を縮小し、style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'z-stack Controlスライダーを使用して、他のz深度の背景光子から発生する信号汚染を最小限に抑えます。
4. FLIM画像をグループに追加するには、+ボタンをクリックしてください（ステップ2.2）。<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'Calcボタンをクリックして、ROIと寿命推定誤差(δτ)の平均寿命(LT、平均光子放出時間[MPET]とも呼ばれます)を計算します。
5.時系列の2pFLIMイメージングシリーズの次のファイルを開きます。手順2.4を繰り返します。時間の経過とともに組織ドリフトが発生する可能性があるため、ROIとzスタック範囲の位置を調整して、同じtAKARα陽性体細胞を経時的に測定してください。
6. deltaMPET/MPET0 のドロップダウンメニューで style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>グループコントロールモジュール。baseline#フィールドをクリックし、インデックスを入力します(例: 1 2 3 4 5 ステップ 2.3 で作成したグループの最初の 5 つの画像)。これは、ベースラインの寿命を計算するために使用される画像を定義します（LT0)。
7.Plotをクリックして、FLIMレスポンス(ΔLT/LT0) 定義された ROI での実験中の tAKARα。個々のROIの寿命(ΔLT)の対応するベースライン寿命による正規化された変化 (LT0) 異なる ROI 間での移動中の PKA 活性の比較を可能にします。
