マウス脳組織における狂犬病ウイルス感染の3次元可視化

要約

出典: Zaeck, L., et al. 溶媒除去された脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング。 J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、狂犬病ウイルス(RABV)に感染したマウスの脳組織を調製し、イメージングして感染の進行を評価するプロセスを示しています。蛍光マーカーによる組織染色、脱水、クリアリング、共焦点レーザー走査型顕微鏡のマウントなど、主要なステップを概説し、最終的に3次元表現の生成に至ります。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

RABV感染、パラホルムアルデヒド(PFA)固定脳のアーカイブ材料を使用しました。

注意:このプロトコルは、さまざまな有毒物質および/または有害物質を使用しています。 PFA、メタノール(MeOH)、過酸化水素(H₂O₂)、アジ化ナトリウム(NaN₃)、tert-ブタノール(TBA)、 ベンジルアルコール(BA)、安息香酸ベンジル(BB)、およびジフェニルエーテル(DPE)。MeOHとTBAは引火性が高いです。適切な個人用保護具(白衣、手袋、目の保護具)を着用し、ドラフトで実験を行うことにより、曝露を避けてください。廃棄物は適切な容器に分別して収集し、地域の規制に従って処分してください。狂犬病ウイルスはバイオセーフティレベル(BSL)-2病原体に分類されるため、一般的にBSL-2条件下で取り扱うことができます。エアロゾルを発生させる可能性のある手順、高濃度のウイルスを扱う手順、または新規リッサウイルスを使用する手順など、一部の活動にはBSL-3分類が必要になる場合があります。曝露前予防は、動物の世話人や実験室の労働者など、リスクの高い人員に推奨されます。地方自治体の規制を参照してください。

1. 脳組織の固定と切片化

1. }脳サンプルをリン酸緩衝生理食塩水(PBS [pH 7.4])で4°Cで少なくとも48時間、適切な量の4%PFAで固定します(組織と固定の比率は約1:10 [v / v])。
2. 組織サンプルをPBSで3回、各洗浄ごとに少なくとも30分間洗浄し、0.02%NaN₃/PBSで4°Cで使用するまで保存します。
3. ビブラトームを用いて組織を厚さ1mmの切片に切片化します(ブレード送り速度:0.3〜0.5mm/s、振幅:1mm、スライス厚さ:1,000μm)。
4. 正しいスライス配列を保持するには、各組織切片をマルチウェル細胞培養プレートのウェルに別々に保存します。0.02% NaN₃/PBSを添加し、使用するまで組織切片を4°Cで保存してください。

2. メタノールによるサンプル前処理

注: すべてのインキュベーションステップを穏やかな振動で行い、特に指示がない場合は室温で行ってください。サンプルを光から保護します。サンプル前処理は、MeOHおよびH₂{{TAG_115 TAG_114}}}}O₂への曝露により、抗体拡散を改善し、組織の自家蛍光を低下させるという全体的な目的を果たします。

1. 蒸留水に20%(v / v)、40%、60%、および80%のMeOH溶液を調製します。例えば、20% MeOHの場合、適切な密閉容器で10 mLの蒸留水に10 mLの100% MeOHを加え、反転させて混合します。
2. サンプルを適度な大きさの容器(5 mL反応チューブなど)に移します。このプロトコルで使用される試薬に対して化学的に耐性のある材料を使用するように注意してください。例えば、ポリプロピレンは適していますが、ポリスチレンは適していないことに注意してください。
   注: このプロトコルの容量仕様は、5 mLの反応チューブを指しています。別の容器を使用する場合は、それに応じて容量を調整してください。
3. 調製した一連のMeOH溶液の各濃度の4 mLでサンプルを昇順で各1時間インキュベートします。
4. サンプルを純粋な(100%)MeOHでそれぞれ1時間ずつ2回インキュベートします。
5. サンプルを4°Cに冷却します(例:実験室で安全な冷蔵庫)。
6. 漂白液(5% H₂O₂)を30%希釈してMeOHで調製します(例えば、H₂O₂}{{}}}ストック溶液を1:6 inで希釈します。
7. 冷蔵サンプルから100% MeOHを取り除き、予め冷却した漂白液4mLを加えます(5% H₂O₂ MeOHで)。
8. 漂白液を4mLの80% MeOHと交換し、1時間インキュベートします。調製した一連のMeOH溶液を降順で1時間ずつ使用し続け、サンプルが4mLの20%MeOHで1時間インキュベートされるまで続けます。
9. サンプルを4mLのPBSで1時間1回洗浄します。

3. 免疫染色

注: すべてのインキュベーションステップを穏やかな振動で行い、特に指示がない場合は室温で行ってください。サンプルを光から保護します。微生物の増殖を防ぐには、このセクションの溶液にNaN₃を最終濃度0.02%まで追加します。組織サンプルは、非イオン性界面活性剤Triton X-100およびTween 20で処理することにより、さらに透過化されます。正常な血清は、非特異的な抗体結合をブロックするために使用されます。グリシンとヘパリンは、免疫標識のバックグラウンドを減らすために添加されます。

1. サンプルを0.2% Triton X-100/PBSの4 mLでそれぞれ1時間、2回洗浄します。
2. 0.2% Triton X-100/20% ジメチルスルホキシド(DMSO)/0.3 M グリシン/PBS 4 mL を使用して、サンプルを 37 °C で 2 日間透過処理します。
3. 0.2% Triton X-100/10% DMSO/6% normal serum/PBSの4 mLにサンプルを37°Cで2日間インキュベートすることにより、抗体の非特異的結合をブロックします。
   注: 理想的なブロッキング結果を得るために、二次抗体が産生されたのと同じ種の正常な血清を使用してください。
4. サンプルを一次抗体溶液2 mL(3%正常血清/5%DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 with heparin]+一次抗体/抗体)で37°Cで5日間インキュベートし、2.5日後に一次抗体溶液をリフレッシュします。
   1. PTwHの場合、ヘパリンナトリウム塩を蒸留水に再構成して10 mg / mLのストック溶液を作ります(この溶液を4°Cで保存します)。ストック溶液を0.2% Tween 20/PBSに添加し、最終濃度10 μg/mLにします。
      注: 正しい抗体希釈を選択するには、最適化が必要な場合があります。一般に、標準的な免疫組織化学濃度は良い出発点です。
5. サンプルを4mLのPTwHで1日間洗浄し、日中に少なくとも4〜5回洗浄バッファーを交換し、最終洗浄は一晩放置します。
6. サンプルを2 mLの二次抗体溶液(3%正常血清/PTwH + 二次抗体/抗体)で37°Cで5日間インキュベートし、2.5日後に二次抗体溶液をリフレッシュします。
   1. 二次抗体を二次抗体溶液(すなわち、2mL中4μL)で1:500に希釈します。
7. ステップ3.5で説明したようにサンプルを1日間洗浄し、最終洗浄は一晩放置します。

4. 核染色

注: すべてのインキュベーションステップを穏やかな振動で行い、特に指示がない場合は室温で行ってください。サンプルを光から保護します。核染色が不要な場合、または別の蛍光色素の励起または検出にチアゾールレッド(TO-PRO-3)の励起波長/発光スペクトルが必要な場合は、このステップをスキップしてください。

1. 核酸染色剤TO-PRO-3をPTwHで1:1,000に希釈し、サンプルを4 mLの核染色溶液で5時間インキュベートします。
2. ステップ3.5で説明したようにサンプルを1日間洗浄し、最終洗浄は一晩放置します。
   注: 洗浄後、サンプルは光学的に透明になるまで4°CのPBSに保存できます。

5. ティッシュクリアリング

注: すべてのインキュベーションステップを穏やかな振動で行い、特に指示がない場合は室温で行ってください。サンプルを光から保護します。組織サンプルは、段階的な一連のTBA溶液で脱水されます。免疫染色には水溶液が必要なため、組織の透明化の前にすべての染色手順を完了する必要があります。光学的クリアランスと屈折率マッチングは、BA、BB、DPEの混合物による処理によって達成されます。清澄溶液には、抗酸化剤としてDL-α-トコフェロールが添加されています。

1. 蒸留水に30%(v/v)、50%、70%、80%、90%、96%TBA溶液を調製します。例えば、TBAが30%の場合は、100%TBAの15 mLを蒸留水35 mLに適切な密閉容器で加え、反転させて混合します。
   注:TBAの融点は25〜26°Cです。したがって、室温では固体になる傾向があります。TBA溶液を調製するには、ウェルシールされたボトルをインキュベーターまたはウォーターバスで37°Cに加熱します。
2. 調製した一連のTBA溶液の各濃度4 mLでサンプルを昇順で2時間ずつ脱水します。96%TBAを一晩放置します。
3. サンプルをさらに純度(100%)TBAで2時間脱水します。
4. 清澄溶液BABB-D15を調製します。
   注: BABB-D15 は BA と BB (BABB) を組み合わせたもので、DPE と x:1 の比率で x がソリューション名に指定されています。 この場合は 15.
   1. BABBの場合は、1部のBAと2部のBBを混合します。
   2. BABBとDPEを15:1の比率で混合します。
   3. 0.4vol%DL-α-トコフェロール(ビタミンE)を添加します。
      注:たとえば、20 mLのBABB-D15の場合、6.25 mLのBAと12.5 mLのBBを混合します。1.25 mLのDPEを加え、0.08 mLのDL-α-トコフェロールを補充します。.
5. サンプルが光学的に透明になるまで(2〜6時間)、清澄溶液でサンプルを清澄化します。
6. サンプルは、BABB-D15で4°Cで保存でき、光から保護され、マウントおよびイメージングまで可能です。

6.サンプルの埋込み

1. }を3Dプリンターでプリントします(材質:コポリエステル[CPE]、ノズル:0.25mm、層高さ:0.06mm、壁厚:0.88mm、壁面数:4、インフィル:100%、支持体なし)。
2. イメージングチャンバーを組み立てます(図1)。
   1. 丸いカバーガラス(直径30mm)をRTV-1(一液型室温加硫)シリコーンゴムで撮像室に取り付けます。余分なシリコーンゴムを水で濡らした綿棒で取り除き、一晩硬化させます。
   2. 丸いカバースリップ(直径:22mm)をRTV-1シリコーンゴムで蓋に取り付けます。余分なシリコーンゴムを水で濡らした綿棒で取り除き、一晩硬化させます。
3. サンプルをイメージングチャンバーに入れ、少量のBABB-D15を加えて蓋をします。皮下注射針(27 G x 3/4 inch [0.40 mm x 20 mm])を使用して、入口からBABB-D15をチャンバーに充填します。
4. インレットを差し込み、イメージングチャンバーをRTV-1シリコーンゴムで密封します。暗闇の中で一晩で硬化します。

7. イメージングと画像処理

1. 使用する蛍光色素に一致するレーザーラインを選択して、画像取得を設定します。各検出器の検出範囲を調整して、チャネル間の信号のオーバーラップを防ぎます。
   注: Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568、TO-PRO-3 の例示的な検出範囲は、それぞれ 500–550 nm、590–620 nm、645–700 nm です。
2. 取得パラメータを選択し、zスタックの上下の境界を定義して、画像スタックを取得します。
   注: 例示的な取得パラメータは、60-90nmのピクセルサイズ、0.5μmのzステップサイズ、1のライン平均、400Hzのスキャン速度、および1エアリーユニットのピンホールサイズのシーケンシャルスキャンです。
3. 適切な画像解析ソフトウェア(フィジーなど)を使用して画像スタックを処理し、3D投影を生成したり、詳細な解析を実行したりします。
   NOTE: 取得した画像ファイルのサイズが大きいため、通常はワークステーションを使用する必要があります。
   1. フィジーで取得ファイルまたは画像ファイルを開きます(ファイル| オープン |ファイル)を選択します。
      1. たとえば、LIFファイルを使用する場合は、[Bio-Formats]ダイアログウィンドウで目的のオプションを選択または選択解除します。Hyperstack でスタックを表示します。それ以外は、特定の選択や目盛りは必要ありません。OKを押します。
      2. ファイルに複数の画像スタックが含まれている場合は、解析する画像スタックを選択し、OKを押して確認します。
   2. 結合した画像を個々のチャンネルに分割して漂白剤補正を行います (Image | カラー | チャンネルツールを選択し、もっと | チャンネル分割)を選択します。各チャンネルで漂白剤補正(画像| 調整| 漂白剤補正)を選択し、シンプルレシオ（背景強度: 0.0).
      注: 場合によっては、たとえば、信号の線形減衰がない場合や、信号が全体的に弱すぎる場合、Simple Ratio が失敗することがあります。または、Exponential Fitを試すか、漂白剤の補正をスキップしてください。
   3. スライダーを使用して各チャンネルの明るさとコントラストを調整します（Image | 調整 | 明るさ | コントラスト)。
   4. チャンネルの統合 (Image | カラー | チャンネルの統合)、合成 (イメージ | カラー | チャンネルツール, 次に、その他 | 合成)に変換し、RGB形式に変換します(画像 | カラー | チャンネルツールを選択し、次に More | RGB)に変換します。
   5. 必要に応じて、画像スタックのサイズを変更して、計算時間とファイルサイズを削減します (画像 | 調整 | サイズ、 両方のオプションにチェックマークが付いており、さらにバイリニア補間が適用されます)。
   6. 3D プロジェクション (Image | Stacks | 3D Project) を生成します。投影方法としてBrightest Pointを選択し、取得した画像スタックのzステップサイズに一致するようにスライス間隔を設定します。最高の品質を得るには、回転角度の増分を1に設定し、補間を有効にします。必要に応じて、回転合計、透明度のしきい値、不透明度を変更します。
   7. 必要に応じて、3D プロジェクションを 8 ビット形式に変換し直してコントラストと明るさを再調整します (Image | Type | 8-bit)。それぞれのスライダー (画像 | 調整 | 明るさ | コントラスト) を使用し、手順 7.3.4 の説明に従って画像スタックを RGB 形式に再変換します。
   8. 3D 投影法を .TIFファイル(画像ファイル形式)と.AVIファイル(動画ファイル形式)です。

結果

材料