マウス脳組織における狂犬病ウイルス感染の3次元可視化

要約

出典: Zaeck, L., et al. 溶媒除去された脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング。 J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、狂犬病ウイルス(RABV)に感染したマウスの脳組織を調製し、イメージングして感染の進行を評価するプロセスを示しています。蛍光マーカーによる組織染色、脱水、クリアリング、共焦点レーザー走査型顕微鏡のマウントなど、主要なステップを概説し、最終的に3次元表現の生成に至ります。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Reagents
ベンジルアルコール	Alfa Aesar	41218	Clearing reagent
安息香酸ベンジル	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	試薬のクリア
ジメチルスルホキシド	Carl Roth	4720.2	Various buffers
Diphenyl ether	Sigma-Aldrich	240834-100G	試薬のクリア
DL-α-Tocopherol	Alfa Aesar	A17039	Antioxidant
Donkey serum	Bio-Rad	C06SBZ	ブロッキング試薬
Glycine	Carl Roth	3908.2	バックグラウンドの削減
ヤギ血清	Merck	S26-100ML	ブロッキング試薬
ヘパリンナトリウム塩	Carl Roth	7692.1	バックグラウンドの削減
過酸化水素溶液 (30 %)	Carl Roth	8070.2	サンプル漂白
Methanol	Carl Roth	4627.4	サンプル前処理
パラホルムアルデヒド	Carl Roth	335.3	固定液を作るための結晶性粉末
アジ化ナトリウム	Carl Roth	K305.1	ストック溶液中の微生物増殖の防止
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	ティッシュクリアのための脱水症状の例
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	核酸染色
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	洗剤
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	洗剤
その他<
5 mL 反応チューブ	Eppendorf	30119401	Sample tubes
Coverslip, circular (diameter: 22 mm)	Marienfeld	111620	イメージングチャンバーの一部
Coverslip, circular (diameter: 30 mm)	Marienfeld	111700	イメージングチャンバーの一部
皮下注射針 (27 G x 3/4" [0.40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Filling of the imaging chamber with clearing solution
RTV-1 シリコーンゴム	Wacker	エラストシル E43	イメージングチャンバーの組み立てのための接着剤
Ultimaker CPE 2.85 mm transparent	Ultimaker	8718836374869	イメージングチャンバーの一部を印刷するための3Dプリンター用のコポリエステルフィラメント
技術機器およびソフトウェア
3D printer	Ultimaker	Ultimaker 2+	イメージングチャンバーの印刷
自動水浸しシステム	Leica	15640019	ソフトウェア制御のウォーターポンプ
Benchtop orbital shaker	Elmi	DOS-20M	室温(~150 rpm)でのインキュベーションを例に挙げます。
ベンチトップオービタルシェイカー、加熱	ニューブランズウィックサイエンティフィック	G24 Environmental Shaker	37 °C (~ 150 rpm)でのインキュベーション
共焦点レーザー走査型顕微鏡	Leica	DMI 6000 TCS SP5	反転共焦点サンプルイメージングのための顕微鏡
Fiji	NIH (ImageJ)	オープンソースソフトウェア (v1.52h)	ImageJに基づく画像処理パッケージ
長時間の水没目標	Leica	15506360	HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica	VT1200S	サンプルスライス
Workstation	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118
		<
			RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4
			SSD: 2 TB
一次抗体
ヤギの反RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		バキュロウイルス発現およびHisタグ精製RABV核タンパク質N
			Dilution: 1:400<
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	ポリクローナル抗体 (RRID:AB_10013382)
			Dilution: 1:100
Rabbit anti-MAP2	Abcam	ab32454	ポリクローナル抗体 (RRID:AB_776174)
Rabbit anti-RABV P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		バキュロウイルス発現およびHisタグ精製RABVリン酸化タンパク質Pによるウサギ免疫によって生成された単一特異的ポリクローナルウサギ抗RABV P血清（参考文献23）Orbanz et al., 2010を参照)
			Dilution: 1:1,000<
Secondary antibodies
ロバ反ヤギIgG	サーモフィッシャーサイエンティフィック	共役蛍光色素による	Highly cross-absorbed
			Dilution: 1:500<
ロバ反マウスIgG	Thermo Fisher Scientific	活用形によるfluorophore	Highly cross-absorbed
			希釈: 1:500
ロバ反ウサギIgG	Thermo Fisher Scientific	結合蛍光色素によります	Highly cross-absorbed
			希釈: 1:500
ヤギの反マウスIgG	Thermo Fisher Scientific	結合蛍光色素によります	Highly cross-absorbed
			希釈: 1:500
ヤギ反ウサギIgG	Thermo Fisher Scientific	結合蛍光色素によります	Highly cross-absorbed
			希釈:1:500

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