スペクトル反射率測定法を使用して、固定マウス脳スライスの有髄軸索直径を決定する

要約

出典:Kwon, J., et al., 有髄軸索のスペクトル反射率顕微鏡法 In Situ. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、ハイパースペクトル共焦点顕微鏡によるスペクトル反射率測定を使用して、固定された脳組織切片の干渉パターンを分析し、有髄軸索径を決定する方法を示します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.キャリブレーション

1. イメージングの少なくとも1時間前に顕微鏡のスイッチを入れて、レーザー光源の熱安定化を可能にします(材料の表を参照)。次に、スペクトルスキャン用のソフトウェア(「材料の表」を参照)をオンにし、GUI(グラフィカルユーザーインターフェース)の上部にある「取得」ボタンをクリックします(図1a)。
2. 白色光レーザー(WLL)と光電子増倍管(PMT)のソフトウェアシャッターをONにします(Figure 1a)。
3. 「Acquisition Mode」のドロップダウンリストでxyΛモードを選択すると、レーザー入力モードが自動的に「Constant percent」から「Constant Power」に変更されます。Automatic SP Movementのチェックボックスをオフにします。次に、Λ励起ラムダスキャン設定(図1b)で、入力レーザーのスペクトルウィンドウを470〜670 nmに、スペクトルステップサイズを4 nmに設定します。
4. PMTのスペクトル範囲を450-690nmに設定するには、スペクトル範囲の調整バーをダブルクリックまたは移動してください(Figure 1c)。
   注: このスペクトル範囲には、入力ソースの完全な帯域幅を含める必要があります。
5. 高開口数(NA > 0.7)の水浸対物レンズを適切に選択し、PMTとレーザー出力に任意の値を与えてAOBS(音響光学ビームスプリッター)構成とライブスキャンボタンをアクティブにします。AOBS Configuration(Figure 1d)で反射を確認して、光路を切り替えます。
6. 顕微鏡ステージにリファレンスミラー(材料の表を参照)を取り付けます。鏡面は対物レンズに面している必要があります。顕微鏡ステージにミラーを取り付けるのが難しい場合は、フラットプレート(}、スライドガラスなど)にミラーを接着します。
7. 顕微鏡ステージを制御して、焦点面を鏡面に合わせます。
8. 検出器のダイナミック レンジを考慮して PMT ゲインとレーザー出力を調整し、レーザー入力モードを [Constant Percent] から [Constant Power] に変更します。
   注: 通常、570 nmでPMTゲイン500 (V)と相対レーザー出力0.1%が使用されます。
9. 擬似カラーモードで確認し、波長範囲全体に彩度がないことを確認します。飽和が観察された場合は、レーザー出力を下げます(図1a)。
10. Lambda Scanの取り込みを実行します。
11. ミラーをステージから取り外し、サンプルなしで同じ取得を繰り返して、暗い参照(、つまり、暗いオフセット)を取得します。
12. データをマルチスタックTIF形式で保存します。

2. SpeRe (スペクトル反射率測定) 画像取得

1. }マウントした組織を顕微鏡ステージに置きます。組織を対物レンズの焦点面に大まかに位置合わせするには、接眼レンズを通して広視野蛍光モードを使用します。
2. ライブスキャンがオンの状態で、顕微鏡ステージを制御して、焦点面を組織の関心領域に合わせます。カバーガラスからのバックグラウンドノイズを避けるために、ガラス-ティッシュ界面から少なくとも15μmの深さのターゲット領域を選択します。
3. ターゲット領域のスペクトル画像スタックを、手順1.1〜1.10で説明したのと同じ手順で取得します。
4. 組織とダークオフセットのデータをMultistacked TIF形式で保存します。
   注: この段階で実験者は一時停止することがあります。

3. 画像処理・解析

1. ImageJのリファレンスミラーと脳組織のスペクトルデータ(マルチスタックTIF)を開きます。
2. 開いた画像スタックのROI(関心領域)を選択します(参照鏡の中央領域と脳組織の軸索線維のセグメント)。
3. ImageJ メニューで Image → Stacks → ImageJ メニューで Z 軸プロファイル をプロットします。
4. 参照鏡用に取得されたデータと脳組織用に取得されたもう 1 つの暗いオフセット データを開きます。
5. ImageJ メニューで Image → Stacks → ImageJ メニューで Z 軸プロファイルをプロットする を実行して、ダークオフセットのスペクトルを取得します。
6. 取得したすべてのスペクトルを、コピー&ペーストオプションを使用して保存します。
   注: SpeReイメージングでは、軸外光学収差を最小限に抑えるために中央イメージングフィールドの使用を推奨します。軸索線維は、その長さに沿って構造的に不均一であり得る。したがって、小さな軸索セグメント(通常は < 5 μm)で ROI を選択して、部分体積アーチファクトを最小限に抑えることをお勧めします。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アポクロマート対物レンズ 40×, NA 1.1	ライカマイクロシステムズ	15506357	水浸タイプ.
フルオロミエリングリーン	サーモフィッシャー	F34651
ライカSP8 TCS顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	SP8
イメージングソフトウェア	ライカマイクロシステムズ	LAS-X
Matlab	MathWorks
ミラー	Thorlabs	PF10-03-P01	保護された銀でコーティングされています。
カバースリップ	サーモフィッシャー	3306	厚さ:#1(0.13〜0.17mm)。
スライドガラス	武藤純薬品店	5116-20F	厚さ:~1mm.
瞬間接着剤	ヘンケル	ロックタイト406	皮膚や目の接触を避けるために、ディスペンシング機器を使用してください。
白色光レーザー	NKTフォトニクス	EXB-6	EXB-6は製造中止となり、EXU-6に置き換えられました。