ライトシート蛍光顕微鏡による運動ニューロンの投射と軸索分岐の可視化

要約

Source: Liau, E. S. et al. マウス胚における運動軸索ナビゲーションの可視化とマウス胚における軸索樹状化の定量化 J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、ライトシート蛍光顕微鏡を使用して、運動ニューロンの投影と軸索の分岐を画像化する方法を示しています。トランスジェニックマウス胚。運動ニューロンの成長と接続性を評価するための軸索分岐のサンプル調製、イメージング、および3D再構築に関連するステップを概説します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理によってレビューされ、承認されています。審査委員会。

1.ライトシート蛍光顕微鏡法(LSFM)(2–3時間)

1. Sample set-up
   1. 5X/0.1 照明光学系と 5X/0.16 検出光学系を設定します。サンプルホルダーとサンプルキャピラリー(内径1.5mm、緑色)を組み立て、顕微鏡に入れます。
      NOTE: 詳細なセットアップ手順については、顕微鏡の操作マニュアルを参照してください。
   2. 次のように胚をマウントします：
      1. P200ピペットチップを毛細管の直径に合うように上部を切り取り、サンプルアタッチメント用の尖った部分(~3mm)を取り除きます。
      2. ピペットチップの鈍い端を小さな炎で溶かします。
      3. 炎を消し、溶けた端に胚を垂直にすばやく取り付けます。
      4. ピペットチップの上部をサンプルキャピラリーに取り付けます。
   3. チャンバーバッファーを胚と1分間平衡化させて、破片や気泡を取り除きます。
   4. イメージングソフトウェアを使用して、Locate capillary Locate tabをクリックし、X、Y、Z軸を調整してサンプルキャピラリーを配置してください。
   5. 選択 Locate sampleして0.6倍にズームし、胚に焦点を合わせます。胚を回転させて、画像化された肢の長軸が2つの光源の光路と一致することを確認します（<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'Figure 1B)。
2. 画像取得
   1. style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>取得 タブで、検出対物レンズ、レーザーブロッキングフィルター、ビームスプリッター、カメラ、レーザーなどの光路パラメータを定義します。
      NOTE: 本実験では緑色蛍光タンパク質(GFP)チャネルを使用しています(励起波長:488 nm、蛍光フィルター:バンドパス(BP)505 - 545 nm、ビームスプリッター:SPS LP 560)。
   2. シャドウリダクションのピボットスキャンチェックボックスをオンにします。
   3. 取得設定を定義します:ビット深度、16ビット。ズーム、0.36-0.7X;片面照明(左/右)または両面照明。
   4. クリック Continuous また、レーザー強度、露光時間、レーザー出力、ライトシートの位置を設定して、より鮮明な画像を取得します。
      NOTE: レーザー出力は、光による損傷を最小限に抑えるために、できるだけ低く抑えられています。
   5. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>STOP 画像の取得を終了します。
3. 多次元取得
   1. 最初と最後の画像のZ位置を移動してZスタックを定義します。<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'Optimal をクリックしてスライス番号を設定します。
   2. Start Experimentをクリックして、選択したz-stackを取得します。
   3. 完了したら、画像を.czi形式で保存します。
4. 画像処理(オプション)
   1. continued with デュアルサイドフュージョン<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>ライトシート処理 デュアルサイドイルミネーションが適用された場合のチャンネル。 マルチビュー処理 は、複数の角度からの画像を組み合わせるためにマルチビューを取得する場合に必要です。
   2. 投影軸に沿った最高強度のピクセルからのデータを使用して2D画像を作成しますMaximum Intensity Projectionチャンネル。
   3. Copyチャネルで、 subset元のセットから画像のサブセットを選択します。

2.軸索樹木の定量化(個々の神経ごとに30分)

1. 画像解析ソフトウェアで画像ファイルを開きます（デフォルトでは、XYZデータを含む画像はSurpassモードで3Dレンダリングビューとして開きます)。
2. 画像の色、明るさ、コントラストを調整します<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Display Adjustmentwindow (編集 |表示調整) は、局所的な強度コントラストに基づいてフィラメントを検出します。
3. 新しいフィラメントを追加アイコンをクリックし、 Autopath (no loop) ドロップダウンメニューのアルゴリズム。
4. 関心領域(この場合は、関心のあるセグメント化軸索)を選択します。クリック<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Next 終了したら。
5. 開始点とシード点を定義するには、最大直径と最薄直径の測定値を割り当てます。これは、Slice モード。
6. 関心領域の端に始点を割り当てます。手動で開始点を追加または削除するには、まずポインタモードを変更します（Navigate |選択) 次にShift + 右クリック 興味のあるポイントで。
7. シードポイントの手動しきい値を選択して、表示されているすべてのアーボライゼーションがマークされるようにします。ポインタモードを変更 (Navigate |選択) 次にShift + 左クリック 手動でシードポイントを追加したり削除したりするためのポイントで。
   NOTE: 隣接する神経からのバックグラウンドノイズと信号を手動で除去することが重要です。
8. ボックスにチェックを入れてください開始点の周りのシードポイントを削除<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>.
9. 確認してください 切断されたセグメントを削除 遠すぎるポイント、およびバックグラウンドノイズを表す可能性のあるポイントを除外できるようにするため。次のステップでMaximum Gap Length 除外。
10. ガウス フィルターを使用してすべてのボクセルの背景強度を推定する背景減算のしきい値を調整します。
11. 樹状突起の直径の自動閾値を設定します おおよその断面積アルゴリズム。
12. スパインの計算の手順をスキップします。
13. プロセスを終了し、希望のスタイルと色を選択します。
14. Properties 再構築された軸索のみを表示します。
15. statistics タブで、 Detailed.<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'Filament No.樹状突起終点 運動軸索の樹状化の指標として運動神経終末を定量化します。
    NOTE: 統計必要に応じて注釈を追加できます。
16. 再構築した軸索の画像を.tifファイルとしてエクスポートします。

結果

材料