扁平化脳切片における皮質モジュールの組織化学的イメージング

要約

出典: Lauer, S. M., 他 Visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、組織化学染色を使用して、平らになった脳切片の皮質モジュールを視覚化する方法を実演しています。あらかじめ固定された切片は、活性神経クラスターを強調表示するストレイン試薬で処理され、暗くてコントラストの高い領域を形成します。マウントと脱水後、皮質モジュールは明視野顕微鏡下で暗く斑点のあるパターンとして現れます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手続きは、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.シトクロムオキシダーゼ染色を使用した皮質モジュールの可視化

注: シトクロムオキシダーゼ活性の組織化学的検出のために、さまざまな染色プロトコルが開発されました。このプロトコルは硫酸ニッケルアンモニウム(NiAS)を使用するため、染色された皮質領域のコントラストが高く、モジュールがより鮮明になります。

1. シトクロムオキシダーゼ染色液を準備します。10 mLの溶液に、10 mLの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液(0.1 M、pH 7.4)、スクロース400 mg、NiAS12.5 mg、シトクロムC2 mg、ジアミノベンジジン(DAB)6 mgを添加します。
   注意: DABとNiASは発がん性があります。
   注: セクションのインキュベーション直前にDABを追加してください。
2. HEPES緩衝液(0.1 M、pH 7.4)の切片をシェーカーで15分間洗浄します。
3. 染色液中の切片を室温でシェーカーでインキュベートします。
   注: 染色の速度を観察してください。目に見える反応がない場合は、37°Cでのインキュベーションに変更し、固定量に応じて、10分後または数時間後に染色を観察できます。
4. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を添加して反応を停止します。これにより、不要な再染色やバックグラウンド信号の増加を防ぐことができます。
5. HEPESバッファーを使用して切片を3回10分間洗浄します。
6. 切片をスライドガラスに取り付けて乾かします。
7. アルコールが増えるセクションを脱水する row：<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
8. スライドを60%エタノールで1分間洗浄します。スライドを80%エタノールで1分間洗浄します。スライドを96%エタノールで2分間洗浄します。スライドを100%エタノールで3分間洗浄します。スライドをイソプロパノールで5分間洗浄します。スライドをキシレンで5分間洗浄します。

すぐにクイック硬化実装媒体を追加し、カバースリップを追加してください。 Critical: 水性封入剤は、NiASが洗い流されて汚れが劣化しますので、使用しないでください。

長期保存のために、切片を4°Cに保ちます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シトクロムオキシダーゼ染色
馬の心臓由来のシトクロムc	シグマ-アルドリッチ	C2506
3,3'ジアミノベンジジン四塩酸塩水和物	シグマ・アルドリッチ	D5637
HEPES	カール・ロス	9105.4
メディアの取り付けまたは凍結
ユーキット (組織化学)	シグマ・アルドリッチ	3989
アルコール脱水症状
エタノール 100%	カール・ロス	9065.3
エタノール 96%	カール・ロス	P075.3
2-プロパノール	カール・ロス	6752.4
キシレン代替品	フルカ	78475
デバイス/ツール
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