動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1. 坐骨神経とDRGの消化
- 消化培地(ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM]、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸[HEPES]、5 mg/mLウシ血清アルブミン[BSA]、1.6 mg/mLコラゲナーゼ4型)に100 μg/mLのデオキシリボヌクレアーゼを添加し、氷上に保存します。
NOTE:マウス(坐骨神経+DRG)1匹あたりに必要な消化培地の量は1mLです。調製後、消化培地のアリコートは-20°Cで保存できます。 - 1匹のマウスから坐骨神経とDRGを、500μLの消化培地が入った別々の1.5mLチューブに移します。坐骨神経の場合は、スプリングハサミを使用して材料を15〜20個に切り刻み、組織懸濁液を37°Cの振とうインキュベーターで20分間、穏やかに攪拌しながら≤450rpmでインキュベー
トします。- 1,000 μLのピペットチップで細胞懸濁液を繰り返し粉砕し、不完全に消化された組織を機械的に解離させます。
NOTE:懸濁液の滴定が難しい場合は、ピペットの先端をハサミで切って端を鈍くします。組織懸濁液を37°Cで20分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします(≤ 450 rpm)。 - 1,000 μLのピペットチップでトリチュレーションを繰り返し、37°Cでさらに10分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします(≤ 450 rpm)。
- FACS緩衝液(10%ウシ胎児血清[FCS]および1mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA]を添加したリン酸緩衝生理食塩水[PBS])を調製し、氷上に保存します。メッシュサイズ140 μmのステンレス製スクリーンを、60 x 15 mmのシャーレに蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファーを塗布した氷上ですすぎ、浸漬します。
NOTE:ナイロンスクリーンフィルターは、有核細胞の収量を大幅に低下させるため、避けるべきです。 - 組織懸濁液を140μmのスクリーンフィルターに繰り返し通します。これは、鈍い鉗子で氷上のシャーレに保持されています。細胞懸濁液をペトリ皿から回収し、氷上に保存した新しい1.5 mLチューブに移します。
- フィルター上に残っている不完全な消化組織を、1,000 μLのピペットチップで繰り返しトリチュレーションして押し込みます。スクリーンフィルターを500μLのFACSバッファーで2回すすぎ、得られた細胞懸濁液をペトリ皿に集めて、ステップ1.6の細胞懸濁液と結合します。
NOTE: 使用するフローサイトメーターがデブリに敏感な場合は、ステップ1.7の細胞懸濁液を70 μmのスクリーンフィルターに通すことができます。しかし、これにより核細胞の収量が減少する可能性があります。 - 細胞懸濁液を300 x gで5分間、4°Cで遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを1 mLのFACSバッファーに再懸濁します。この洗浄手順を一度繰り返します。
- 必要な染色回数に応じて、細胞ペレットを150〜350μLのFACSバッファーに再懸濁します(染色パネルあたり150μLのFACSバッファー)。
2. フローサイトメトリーのための蛍光標識抗体による坐骨神経とDRGの染色
- 100μLの坐骨神経またはDRG細胞懸濁液を、氷上の96ウェルプレートのV字型ウェルに移します。
NOTE: シングル染色細胞は、光電子増倍管(PMT)の電圧ゲインと補償に関してフローサイトメトリーを設定するために必要な制御を提供し、特異的結合と非特異的結合を区別するのに役立つため、使用するすべての抗体に必要です。 - 坐骨神経またはDRGサンプルのいずれかから残りの細胞懸濁液(サンプルあたり約50μL)をプールして、未染色のコントロールとして機能します。
- プレートを400 x gで4°Cで5分間遠心分離し、プレートをビンの上に反転させ、手首を鋭くフリックして上清を捨て、ペーパータオルで軽くたたいて乾かします。
- 表面染色のために、目的の抗体(CD45-A647、CD11b-PerCP/Cy5.5、および主要組織適合遺伝子複合体[MHC]クラスII-ビオチン)を含む20 μLのFACSバッファーに各細胞ペレットを再懸濁し、光から保護して氷上で30分間インキュベートします。
NOTE: (1) 最適な抗体希釈は、使用前にメーカーの製品情報に従って希釈シリーズを行うことにより決定する必要があります。(2)非特異的な染色は、製造元の指示に従って、このステップでFcブロックとインキュベートすることにより低減できます。(3)アイソタイプコントロール染色は、蛍光色素と直接結合した一次抗体を使用する場合、および/または目的の抗原が異なる集団を産生する場合、一般的には必要ありません。 - 各ウェルに130μLのFACSバッファーを加え、プレートを400×gで5分間、4°Cで遠心分離します。前述のように上清を廃棄し(ステップ2.3)、細胞ペレットを150μLのFACSバッファーで2回洗浄します。
注: 非標識一次抗体またはビオチン結合した一次抗体を使用する場合は、この時点で蛍光色素に結合した適切な二次試薬を添加し、ステップ2.4-2.5を繰り返すことができます。このプロトコルの場合、ストレプトアビジン-PE/Cy7またはストレプトアビジン-PerCPを使用して、CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5と組み合わせて、またはCD68-APCおよびF4/80-PE/Cy7と組み合わせてMHCクラスIIを検出しました。 - 固定のために、最後の洗浄ステップの後、細胞ペレットをPBS(pH 7.4)の4%パラホルムアルデヒド100μLに再懸濁します。プレートを氷上で10分間インキュベートし、次いで400 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、前述のように上清を廃棄し(ステップ2.3)、細胞ペレットを150μLのFACS緩衝液で1回洗浄する。
注意:パラホルムアルデヒドは有毒です。手袋や眼鏡などの適切な保護具を着用してください。 etc.
注: 細胞ペレットを150μLのFACSバッファーに再懸濁し、光から保護して4°Cで最大2日間保存してください。細胞内染色が不要な場合は、プレートを400 x gで4°Cで5分間遠心分離した後、ステップ2.11に進みます。 - 細胞内染色の場合は、細胞ペレットを150 μLのFACSバッファー+0.5%界面活性剤に再懸濁し、室温で15分間光から保護してインキュベートします。プレートを400 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、前述のように上清を捨て(ステップ2.3)、細胞ペレットを150 μLのFACSバッファー+0.5 %界面活性剤で1回洗浄します。目的の抗体(CD68-APC、CD206-PE)を含む20 μLのFACSバッファー+0.5%界面活性剤に細胞ペレットを再懸濁し、光から保護して室温で30分間インキュベー
トします。- 各ウェルに130μLのFACSバッファー+0.5%界面活性剤を加え、プレートを400×gで5分間、4°Cで遠心分離します。前述のように上清を捨て(ステップ2.3)、細胞ペレットを150μLのFACSバッファー+0.5%界面活性剤で2回洗浄します。
注: 非標識一次抗体またはビオチン結合した一次抗体を使用する場合は、この時点で蛍光色素に結合した適切な二次試薬を添加し、ステップ2.9-2.10を繰り返すことができます。 - 細胞ペレットを150μLのFACS緩衝液+0.5%界面活性剤に再懸濁し、光から保護して4°Cで最大2日間保存してください。
- 細胞ペレットを150 μL FACSバッファー+0.5 %界面活性剤に5 μg/mL4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を添加して再懸濁し、室温で5分間インキュベートし、光から保護します。プレートを400 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、前述のように上清を捨てます(ステップ2.3)。
- 細胞ペレットを150 μLのPBSに再懸濁し、適切に標識されたFACチューブに移します。分析の準備が整うまで、光から保護された室温で保管してください。
NOTE: PBSで再懸濁した後、DAPIはDNAからゆっくりと解離し、シグナルの損失につながるため、数時間以内に細胞を分析する必要があります。
3. フローサイトメトリーの設定とサンプルの実行
- フローサイトメーターに、細胞の染色に使用される蛍光色素を測定するための適切なレーザーおよび/またはフィルターセットが装備されていることを確認してください。これは、システムのデフォルトのサイトメーター設定で判断できます。このプロトコルの場合、3つのレーザー(405 nm、488 nm、および633 nm)を備えたフローサイトメーターを使用して細胞を解析し、≤5つの蛍光色素を検出しました。
- 目的の蛍光色素の検出に適したチャンネルを選択します。すべての蛍光シグナルは、対数増幅で検出するのが最適です。
- サンプルに適した流量を選択します。このパラメータは、使用するシステムによって異なるため、経験的に決定する必要があります。このプロトコルの場合、針の目詰まりを防ぐために、MED-to-HI(35-60μL / min)の流量が使用されました。
- サンプルごとに収集するイベント/セルの総数を選択します。イベントの最小数は 1,000,000 にする必要があります。
- 側面散乱光領域(SSC-A)と前方散乱光領域(FSC-A)のグローバルワークシートの下に散布図を作成し、FCS-Aに対して対象の蛍光色素分子ごとに散布図を作成します。選択した蛍光色素のイベント数と平均蛍光強度(MFI)を表示する統計ビューを作成します。
- FSC-AチャネルとSSC-Aチャネルの電圧を、最小のセルが散布図の左下10%に収まるように設定します。坐骨神経または DRG の未染色コントロールからのバックグラウンド蛍光と最小サンプル蛍光を決定します。DAPI のみの染色コントロールからの散布図に基づいて親 (P1) ゲートを決定します。
NOTE: これは、末梢神経系 (PNS) の DAPI+ 集団の不均一な性質に一部起因するため、収集ゲートではありません。 - 対象の各蛍光色素のFSC散布図を使用して、未染色コントロールの細胞がそれぞれの散布図の下4分の1に収まるように電圧を調整します。次に、この領域の上にゲートが作成され、それぞれのマーカー/蛍光色素に対して陽性の細胞が定義されます。ゲートの配置は、シングルステンドコントロールの実行(ステップ2.1)によって確認されます。
注: 重複する発光スペクトルの補正は、この時点で実行するか、適切な解析ソフトウェアを使用して遡及的に適用できます。 - フローサイトメーターをセットアップしたら、説明したようにサンプルを分析できます。
- 分析後、残りのサンプル材料を破棄し、FCSファイルをエクスポートしてさらに分析することができます。
