出典: Jagodzinska, J., et.al., 光コヒーレンストモグラフィー:マウス網膜神経節細胞のイメージング In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)
このビデオでは、視神経障害を持つ遺伝子改変マウスモデルにおいて、スペクトル領域光干渉断層撮影法(SD-OCT)を使用して網膜層を画像化し、構造変化を評価する方法を示します。
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方法論記事
光干渉断層撮影法によるマウス網膜のin vivoイメージング
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2025年5月29日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1。マウスの準備
- 目の拡張と固定
- データ取得の少なくとも15分前に、マウスの目に10%のフェニレフリン点眼薬を注入し、余分なものを取り除きます。 0.5%トロピカミド点眼薬を点眼します。
NOTE: 最初の拡張は、セッションでテストされるすべてのマウスに対して一度に行うことができます。液体が室温にあることを確認してください。 - 全身麻酔を誘発した直後 (ステップ 1.2)、0.4% オキシブプロカイン 塩酸塩点眼薬を投与し、3 秒間所定の位置に保持して麻酔をかけ、目を固定します。その後、滴を拭き取り、10%のフェニレフリンと0.5%のトロピカミドの点滴を繰り返して、目が十分に拡張していることを確認します。
注: 液体が室温にあり、マウスがオキシブプロカインを飲み込まないようにしてください。
- データ取得の少なくとも15分前に、マウスの目に10%のフェニレフリン点眼薬を注入し、余分なものを取り除きます。 0.5%トロピカミド点眼薬を点眼します。
- 全身麻酔
- 生理食塩水にケタミン(20 mg/mL)とキシラジン(1.17 mg/mL)の麻酔液を準備します。4°Cで最大2週間保存してください。
- 試験の約5分前に、マウスの年齢とサイズに応じて、体重1 gあたり5〜10 μLの麻酔薬溶液を腹腔内に注入します。
注: 若いマウスや痩せたマウスは、麻酔薬が少なくて済み、麻酔にかかる時間も短く、また、より早く目覚めることができます。ここでは、8μL / g(ケタミン160mg / kg、キシラジン9.33mg / kg)です。 - 必要に応じて、角膜の乾燥を避けるために、粘性のある点眼薬または眼科用ジェルで目を滑らかにします。
2. マウスポジショニング
- 粘性のあるグリコールベースの点眼薬で目を滑らかにし、角膜の水分補給を行います。
注: 検査中に目が乾いているように見える場合は、点眼薬を再度塗布してください。 - マウスを外科用ガーゼで包み、保温します。
- スポンジまたは綿の芯を使用して、0.3%ヒプロメロースを含む眼科用ジェルの薄層を各目に塗布し、光の屈折を最小限に抑え、混濁を避け、角膜の水分補給を確保します。その際、まつげとひげを脇に動かします。
- マウスをカセットに置き、頭をまっすぐにして前を向きます。
- バイトバークランプをそっと開き、バーを口の中に入れます。ノーズバンドを使用して位置を固定します。
注: バイトバーがカセットの中央にあることを確認してください。 - 右(左)の目をテストする場合は、右側(左側)の下にコットンロールを置きます。
- クリップオンエイミングチップをマウス専用レンズに付けたまま、Z変換ネジを反時計回りに回して目に向けてください。
- カセットを回転させて回転させ、バイトバーとXトランスレータネジを回して、マウスの位置を事前に設定します。目標は、右目がレンズを直接見るようにし、目とレンズの光軸を揃えることです。
NOTE: マウスが高すぎたり低すぎたりすると、最初にYトランスレータネジを使用してください。 - 「Exam」で最初のスキャンを選択し、「Start Aiming」をクリックして、網膜イメージングのさらなる手動調整を行います。
- Zトランスレータネジを使用して、左パネル上で網膜を垂直に動かし(Figure 1、水平B-スキャンアライメント)、右パネルを水平に動かします(Figure 1、Vertical B-scan Alignment)。
- ONHを上下に動かして、カセットを回転させてONHを右側のパネルの中央にくずらします。バイトバーネジを使用して、右側のパネルの網膜をまっすぐにします。カセットを回転させて、ONHを左側のパネルの中央に配置します。
- Xトランスレータネジを使用して、左側のパネルの網膜を水平にします。各モジュレーターの主要な機能を念頭に置いて、網膜の位置をさらに調整してONHを集中させます。
注: 必要に応じて、Yトランスレータネジを使用してONHを右側のパネルで上下に動かします。位置は、スキャンの合間にいつでも微調整できます。
3. ONHと網膜のSD-OCTイメージング
- 調整が完了したら、「スナップショットの開始」をクリックしてSD-OCTスキャンを開始します。
- 3Dイメージングが不要な場合は、OCUオプションのチェックを外します。
- スキャンとレポートを保存します。
- 次のスキャンに進みます。
- 2番目の目を撮像するには、レンズを引っ込めた後、それに応じてカセットを回し、手順2.6〜3.3を繰り返します。
4.取得完了
- 取得が完了したら、マウスをカセットから取り出し、0.3%ヒプロメロースを含む眼科用ジェルを各眼に塗布し、マウスを加熱プレートの上に置いて目を覚まします。
- 最後の取得後、ソフトウェアを閉じ、コンピューターとOCTマシンの電源を切ります(電源ボタン)。
- 消毒剤でカセットを清掃します。
5.解析
- 網膜層の厚さ測定には、メーカーが提供する自動セグメンテーションソフトウェアを使用してください。
- 「患者」をクリックし、リストから目的の「検査」を選択し、「レビュー検査」オプションをクリックします。
- 目的のスキャンのフォルダアイコンを右クリックして、目的のOCTデータをOCTソフトウェアにロードします。
- Bスキャンを右クリックします。最大10個の測定キャリパーを有効にしてキャリパーを構成します。をクリックし、名前、角度、色を入力します。
- B-スキャンを右クリックして目的のキャリパーを選択します。それに応じて網膜に置き、測定します。
NOTE: ONHを中心としたスキャンでは、ONHの両側に5つのキャリパーを等間隔でセットします。乳頭周囲解析では、キャリパーがONHから離れすぎていないことを確認してください。ラジアルスキャンの場合、OCTソフトウェアによって選択されたスキャンごとに10枚の画像を分析します。それらの番号は「レポート」フォルダにあります。 - B-スキャンを右クリックして「Save results」をクリックし、スプレッドシートソフトウェアプログラムで分析用の結果を保存します。
NOTE: 結果はスキャンデータと同じフォルダにあります。
- または、オープンソースの画像処理プログラム用に開発された自家製のキャリパーマクロ「MRI Retinaツール」を使用します(資料の表を参照)。
- 「MRI Retina ツール」マクロと「ポリゴン断面変更ツール」マクロがアクティブになっていることを確認します。画像を読み込みます。mボタンをクリックして測定を開始します。
注: マクロは、ONHの両側に長さ0.2mmの測定カセットを1つ自動的に作成します。各カセットには、キャリパーとして機能する5つの測定ポイントが含まれています。それらの横方向の位置は変更できず、ラジアルスキャンの乳頭周囲用にカスタマイズされています。カセットの水平位置は、RNFL/GCLの厚さを測定するために事前に定義されていますが、GCコンプレックス層を測定するように簡単に変更できます。スキャン品質が悪い場合は、水平位置を調整するか、画像を分析から除外する必要があります。 - 水平方向の調整は、eボタンをクリックします。新しく開いた「ROI Manager」ウィンドウで、最初のカセットを選択します。
- 青いポリゴンボタンをクリックし、写真の測定されたレイヤーの境界線をクリックして最初のカセットの位置を調整します。
- 2番目のカセットについても、最初に「ROI Manager」ウィンドウで選択し、次に適切な画像をクリックして、この手順を繰り返します。rボタンをクリックして再測定します。「測定」ウィンドウで結果を表示します。
注:結果はいつでもスプレッドシートソフトウェアプログラムにコピーできます。これらには、右カセット(r)、左カセット(l)、および合計の値が含まれています:Intden - カセット内の積分密度。面積:測定の面積、mm2。Len:カセット内のキャリパーの長さ(mm単位)。平均:カセット内の信号の平均強度。Std:信号の平均強度の標準誤差。 - 次の画像に進みます。
- スプレッドシートソフトウェアプログラムでデータをさらに分析します。
注:レイヤーの平均厚さを見つけるには、10個のLen値を取ります。
- 「MRI Retina ツール」マクロと「ポリゴン断面変更ツール」マクロがアクティブになっていることを確認します。画像を読み込みます。mボタンをクリックして測定を開始します。
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結果
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | |||
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | |||
| ImageJ 1.48v | 分析用のソフトウェアは、2つの手作りマクロをダウンロードしてインストールする必要があります：http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool | ||
| 自己調整型加熱プレート | |||
| Supplies | |||
| ガーゼパッド 3"x3" | |||
| Dual Ended Cotton tip applicator | |||
| Cotton Twists | |||
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | |||
| Mydriaticum 0.5% | |||
| Cebesine 0.4% | |||
| Imalgene 1000 | |||
| Rompun | |||
| NaCl 0,9% | |||
| Systene Ultra | |||
| GenTeal' | |||
| Aniospray Surf 29 |
