形質導入マウス胚脳切片における皮質ニューロン放射状移動のタイムラプスイメージング

要約

出典: Wiegreffe, C., et. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain using In Utero エレクトロポレーション. J. Vis. Exp. (2017)

}このビデオは、形質導入マウス胚脳スライスの放射状グリア足場を介して、脳室内ゾーンから皮質プレートへの皮質ニューロンの放射状移動を観察するタイムラプス共焦点顕微鏡法を示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.タイムラプスイメージング

1. 顕微鏡のセットアップ
   1. 倒立共焦点顕微鏡のステージに置かれたクライメートチャンバーを37°C、5%の二酸化炭素雰囲気に設定します。ハイブリッド検出器を使用して、レーザー強度を下げ、細胞生存率を向上させます。詳細な分析を行うには、開口数が0.6以上の超長作動距離40倍乾式対物レンズを使用します。
      注: 顕微鏡のすべてのコンポーネントは、イメージングプロセス中に安定した焦点を提供するために、イメージング前に2〜3時間37°Cに事前に温める必要があります。
2. スライスイメージング
   1. 逆蛍光顕微鏡を用いて、メンブレンインサートを含む6ウェルプレートからイメージング用の脳スライスを選択します。
      注意: 紫外線に長時間さらされることは、細胞の光損傷を引き起こす可能性があるため、避けてください。
      注: 上部SVZ(脳室下ゾーン)の明るい単一ニューロンがスライスのピアル表面に向かって放射状に移動するスライスを選択します。CP(皮質板)全体にまたがる放射状グリア細胞の微細な蛍光過程は、放射状に移動する皮質ニューロンによって使用される無傷の放射状グリア足場を示しています。
   2. タイムラプスイメージング用に選択したスライスを入れたメンブレンインサートを、鉗子を使用して2mlのスライス培養培地を含む直径50mmのガラス底皿に移します。ディッシュを共焦点顕微鏡のクライメートチャンバーに入れます。
   3. 解像度を512 x 512ピクセルに設定し、スキャン速度を400 Hzから700 Hzに上げると、フレームレートがそれぞれ約1.4フレーム/秒から約2.5フレーム/秒に増加します。平均化は 2 回以下で行ってください。エレクトロポレーション領域(通常は400〜100μm)を通るzスタックを、ステップサイズ1.5μmで定義します。これらの設定を組み合わせることで、画像の十分な解像度と明るさを確保しながら、取得中の光ダメージを低く抑えることができます。30分ごとにZスタックを撮影して、タイムラプスシリーズを開始します。
      注: レーザー光線に長時間さらされると、光損傷が誘発され、細胞の生存率が低下します。それに応じてレーザー光への露光時間を調整します。
   4. ImageJソフトウェア(https://imagej.nih.gov/iij/)または同等のソフトウェアを使用してタイムラプスシリーズを分析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6-well plate	corning	351146
反転蛍光組織培養顕微鏡	ライカ	DM IL LED
共焦点レーザー走査型顕微鏡	Leica	TCS SP5II
Hybrid detector	Leica	HyD
Objective, 40x/0.60 NA	Leica	11506201
顕微鏡温度制御システム	Life Imaging Services	Cube, Brick & Box
細胞培養挿入	Millipore	PICM0RG50
Microgrinder	Narishige	EG-45	斜角に38°の角度を使用
Microinjector	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III
5 mm platinum disk electrodes付きピンセット	Sonidel	CUY650P5
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Box filament	Sutter Instrument	FB255B	2.5 mm x 2.5 mm
Micro-spoon spatula	VWR	231-0191	185 mm x 5 mm
ガラス底皿、50 mm	World Precision Instruments	FD5040-100<

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