虚血性脳卒中のマウスモデルにおける梗塞形成を検出するためのTSPO-PET / CTイメージング

要約

出典:Chaney, A. M., et.al.虚血性脳卒中のマウスモデルにおける [¹¹C]DPA-713 を使用した神経炎症のPETイメージング。 J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、TSPO特異的放射性トレーサーを使用して、虚血性脳卒中のマウスモデルにおける神経炎症のin vivoイメージング技術を示しています。注射後、放射性トレーサーは、ミトコンドリア外膜に位置し、活性化された免疫細胞で過剰発現するタンパク質であるTSPOに結合します。PET/CTスキャナーは、放射性トレーサーの分布を検出し、CTデータと同時登録された画像を生成することで、脳内の神経炎症領域の正確な局在化を可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. PET/CTキャリブレーションとワークフローのセットアップ(dMCAO手術後6日)

1. }CT減衰取得、60分間のC-11ダイナミックPET取得(350〜650 keVレベルの識別、3.438 nsの一致ウィンドウ)を含むイメージングワークフローをスキャナー操作ソフトウェアで作成します。 ヒストグラム(20フレーム:5 x 15秒、4 x 1分、11 x 5分、デッドタイム補正あり)と3DOSEM-OP再構成(2回の反復、18のサブセット)により、0.776 x 0.776 x 0.96 mmのボクセルサイズで128 x 128 x 159の画像を作成します。
2. インターフェースの左上隅にあるCTキャリブレーションパネルを介してX線源のコンディショニングを実行します。このキャリブレーションは、システムが過去48時間以内に使用されていない場合は、毎週、またはスキャン前に実行する必要があります。
3. ダーク/ライト(D / L)およびセンターオフセット(C / O)キャリブレーションを実行します。
   1. インターフェースの左上にあるCTキャリブレーションボタン(X)を押します。
   2. 実行するCTファイルのD/LとC/Oを選択し、ガントリーからベッドを取り外してD/Lキャリブレーションを実行します。
   3. キャリブレーションツールベッドをスキャナーに挿入し、C / Oキャリブレーションを実行し、インターフェースの選択を「70mmパレット」ではなく「キャリブレーションツール」に切り替えてください。
4. キャリブレーションツールを取り外して標準のPETベッドを戻し、インターフェースの選択を「70mmパレット」に戻してください。
5. 4マウスのイメージングベッドをテープでスキャナープラットフォームに固定し、麻酔チューブ（図1A)を取り付けます。イソフルランがチューブを通って流れていること、およびよじれがないことを確認してください。
6. ベッドを前方に押して視野(FOV)の中央にくると、CTドアを閉じてCTのスカウトを取得します view ベッドが正しい位置にあることを確認します。
7. 放射線源として既知の線量のC-11溶液を含む自社製造のファントムを使用して、PET/CTスキャナーの「標準」キャリブレーションを実行します。
   1. 1匹のマウスに投与されたのと同等の用量のトレーサーで満たされた20mLシリンジを準備します(生理食塩水で希釈したC-11トレーサーの~250 - 350 μCi/9 - 13 MBq)。
   2. 線量キャリブレーターを使用して標準器に活性を記録し、測定時間を記録します。
   3. マウスの画像化に使用されるのとまったく同じパラメータを使用して、標準のPET/CTスキャンを実施します(上記のとおり)。これを毎週行って、PETスキャナーがイメージングデータに適用する補正係数を作成します。

2. PET/CTイメージング用のワークスペース設定

1. }殺ウイルス剤を含む消毒剤を使用し(Table of Materialsを参照)、すべての表面に保護吸収剤パッドを配置して、無菌環境を作り出します。
2. イソフルランと酸素ボンベが十分に満たされていることを確認してください。
3. 尾静脈カテーテルを準備するには、1 mL のシリンジ (27.5 G の針先が取り付けられています) に 0.9% 塩化ナトリウム (滅菌生理食塩水) を充填し、27.5 G、24 cm のバタフライ カテーテルで洗い流します。カニューレ挿入前にカテーテルの翼を切り取り、尾静脈の視界を遮らないようにし、カテーテルを移動させることなくマウスをスキャナーに簡単に移動できるようにします。
4. 予備の「フラッシュ」シリンジ(滅菌生理食塩水で満たされた)、アイ潤滑剤、エタノールスワブ、ヒートランプ、準備されたカテーテル(生理食塩水で事前に充填されたもの)、サージカルテープ、組織接着剤、0.5 mL用量のシリンジ、はさみ、および尾静脈(図1B)}にカテーテルを密封するライターなど、すべての重要な機器がワークステーションに配置されていることを確認します。

3. 動物の調製とカニューレ挿入

1. マウスの体重を測定し、各マウスに注入できる最大量を決定します(、つまり、の量と投与される生理食塩水の量は、体重の10%を超えてはなりません)。
2. 3%イソフルランを使用して誘導チャンバー内でマウスを麻酔し、1〜2%(2 L / min 100%O₂)。.
3. 各マウスに眼の潤滑剤を塗布し、ペダル反射(つま先をつまむ)で麻酔を確認します。必要に応じて麻酔レベルを調整します。
4. マウスをノーズコーンを取り付けた加熱ベッドに置き、イソフルランを1〜2%(2 L / min 100% O₂)で送達します。
5. マウスを麻酔している間、次のプロトコルを使用して尾静脈カニューレ挿入を行います:
   1. マウスを横向きにして側静脈の1つを露出させますが、頭は鼻円錐に残ります。
   2. ヒートランプを使用してテールを温め、テールを過熱したり火傷したりしないように注意し、アルコールワイプで綿棒で静脈を拡張し、注入部位を滅菌します。
   3. ベベルを上にして針を持ち、鋭角に静脈に合わせます。
   4. 軽く圧力をかけて皮膚に穴を開け、針を水平にして静脈と一直線になるようにします。
   5. ベベルを数ミリ過ぎてゆっくりと前方に押し込み、針が静脈に入るようにします。
   6. 少量(10-20μL)の生理食塩水を投与して、カテーテルが挿入されていることを確認します。生理食塩水はシリンジからスムーズに離れ、静脈がきれいになるはずです。抵抗や背圧が観察された場合は、カテーテルが静脈内にない可能性が高く、カニューレ挿入を再試行することをお勧めします。凝固が観察される場合は、カニューレ挿入のセットアップとフラッシングにヘパリン(生理食塩水あたり1,000ユニットのヘパリン)を使用してください。
      注: 私たちは、目的のマウス株でヘパリンの有無にかかわらずカニューレ挿入を評価し、凝固が観察されなかったため、カニューレ挿入には生理食塩水のみを使用しました。
   7. 少量の組織接着剤と続いてサージカルテープを使用してカテーテルを尾に固定し、マウスをスキャナーに移すときにカテーテルが動かないようにします。
   8. カテーテルの端からフラッシュシリンジを取り外し、ライターで端を密封して、研究者がイソフルランやエタノールの近くにいないことを確認します。
   9. さらに3匹のマウスについても繰り返して、スキャンする4匹のマウスすべてにカニューレを挿入して準備します。
6. PET/CTに接続された麻酔フロー(2.5%イソフルラン、2L/分、100%O₂)をONにし、マウスをスキャナーベッドにうつ伏せに慎重に配置し、カテーテルが所定の位置に留まり、各マウスの頭がまっすぐでノーズコーン内に固定されていることを確認します。各マウスの頭と体を柔らかい外科用テープでベッドにテープで固定し、テープの配置によって呼吸が制限されないようにします。各マウスの位置を記録して、画像分析の正しい位置とグループの割り当てを可能にします。
7. 処置中、マウスを温め続けます(例:ヒートランプまたはホットエアポンプシステムを使用して、マウスが過熱せずに暖かく保たれるように、{{TAG_287 TAG_290}}{{TAG_291 TAG_288}}{{TAG_292 TAG_289}}例)。オープンガントリーを使用する場合は視覚的に、呼吸パッドを使用して遠隔監視システムを通じて、すべてのマウスの呼吸数を監視し、必要に応じて麻酔レベルを変更します。

4. CT取得

1. 動物がベッドに固定され、呼吸が安定したら、レーザー十字線をオンにし、スキャンベッドを動かして、4匹すべてのマウスの脳に合わせます。スキャナーベッドをマウスの脳がFOVの中心にできるだけ近づけて、取得位置(位置3)に移動します。
2. マウスのスカウトビュー画像を取得してマウスの位置を確認し(200 mm FOVを使用)、必要に応じてインターフェース上のFOVボックスをドラッグして位置を調整します。スキャナーソフトウェアの「Start Workflow」をクリックしてCTスキャンを開始し、トレーサー注入前にPETスキャンを手動で開始できるように、「Display Interactive User Prompts」を選択してください。

5. [¹¹C]DPA-713 用量製剤

1. を合成します [¹¹C]DPA-713, 放射能を取り扱うための適切なPPE(個人用保護具)を着用していることを確認してください。これには、白衣、手袋、個人用の指と体の線量計が含まれます。放射能汚染を防ぐために定期的に手袋を交換し、可能であれば放射線源からの距離を広げてください。
2. 鉗子を使用して、放射性トレーサーバイアルを鉛シールドの後ろに慎重に移します。
3. 100-200 μL の容量で約 250-350 μCi/9-13 MBq を含む各マウスに 0.5 mL の用量シリンジを準備して、60 分間の動的 PET スキャンに適した用量を確保します (投与される用量は、同位体の半減期と研究デザインのタイムラインを考慮して決定する必要があります。容量はマウスの体重によって異なります)。
4. カニューレ挿入部位のすぐ近くにあるC-11に設定された線量キャリブレーターを使用して活性を測定し、測定と注射の時間を記録して崩壊補正を可能にします。CTが終了する直前に線量を算出して、崩壊を抑え、各マウスに所望のレベルの放射能が注入されるようにします。
5. 活性を測定して各マウスに注射する前に、用量シリンジに気泡がないことを確認してください。

6. PET取得

1. マウスが自動的にCTからPETに進んだら、スキャナーの背面を[¹¹C]DPA-713インジェクション(図1C)に設定します。棚に保護吸収パッドを置き、はさみとライターが手元にあることを確認します。
2. 密閉されたカテーテルチューブをハサミで切り取り、カテーテルラインに気泡がないことを確認し、10〜20μLの生理食塩水フラッシュを実行してカニューレがまだ静脈内にあることを確認します。ステップ5.4で測定した用量のシリンジを4本のカテーテルのそれぞれに装填し、各マウスにどの用量が与えられたかを追跡します。
3. PETスキャンを開始する準備ができたら、「OK」をクリックし、同時に10秒のタイマーを開始します。スキャナーの後ろに2人の研究者が線量注射器を手にして、タイマーがゼロになったときに4匹のマウスすべてを同時に注射します。各カテーテルを50〜100μLの生理食塩水(カテーテルチューブの長さによって異なります)で洗い流します(カテーテルチューブの長さによって異なります—、つまり)が尾静脈に入ることを確認し、ライターを使用してチューブを再度シールします。
4. 線量キャリブレーターを使用して線量シリンジを測定し、残留放射能値(シリンジに残っているトレーサー)を取得します。値と記録された時刻をメモします。
5. スキャンが完了したら、モーションコントロールパネル内の水平の「ホーム」ボタンを使用して、PETベッドを元の位置にホームに戻します。スキャナーからマウスを取り外し、カテーテルを慎重に取り外します。カニューレ挿入部位に優しく圧力をかけ、過度の出血を防ぎます。
6. 用量キャリブレーターを使用して、カテーテル内の残留活性を測定します。
7. マウスを回収する場合は、回復を容易にするために、暖かい環境(など、の箱の下に加熱パッドがある箱、または温水で満たされた手袋が入った箱)で行ってください。マウスを安楽死させることを計画している場合は、マウスをイソフルランを含む誘導チャンバーに入れて、灌流による安楽死の前にマウスが麻酔をかけられたままになるようにします。.
8. データを再構築するには、後処理管理ソフトウェア(Table of Materialsを参照)を開き、lstファイルから生成されたヒストグラムデータを使用して各スキャンを自動的に再構築します。

7. 動的PET画像解析

1.画像解析ソフトウェア(Table of Materialsを参照)を開き、「オープンデータ」アイコンをクリックしてCT画像(ソースとして)を読み込み、「データを追加」アイコンをクリックしてダイナミックPETを(参照として)読み込みます。

2. ドロップダウンメニューの時系列演算子を使用して、データの視覚的な品質管理を実行します:参照(「参照」)と「グローバル」を選択し、カラースケールに適切な最小値と最大値を適用します。動的PETデータをフレームごとに視覚化し、放射能の取り込みを確認し、スキャン内の動きの交絡を確認しますTAG_491 TAG_490 TAG_489 TAG_488 TAG_487 TAG_486。「算術演算子」を使用して平均PET画像を作成します。

1. 「平均選択」を選択し、「ref」の選択を解除し、入力1(「Inp1」)、入力2(「Inp2」)、および入力スター(「Inp *」-スキャンに残りのPETフレームを含める)が選択されていることを確認して、すべてのPETフレームの平均を作成します。

2.「データマネージャー」タブ(DM)に移動し、視覚化のために平均画像を「input1」の位置までドラッグします。「最小-最大」ツールで自動計算をクリックして、カラースケールを再配布します。

4. 「向き変更/登録」ドロップダウンメニューの「自動3D」機能を使用して、CTを平均PETファイルに登録します。

1. 「ref」と「Inp1」を選択し、「rigid」、「fast」、「Inp1 to Ref」登録を選択します。3次元すべてのレジストレーションを視覚的に確認し、必要に応じて「手動3D」タブで「平行移動」および「回転」機能を使用して手動で調整します。

2. 登録に問題がなければ、「Inp2」と「Inp*」を選択し、チェックマークをクリックしてすべてのPETフレームに適用します。DMのCTファイルとPETファイルを右クリックし、rawとして保存します。

5. CTをガイドとして使用して、脳分析のために一度に1匹のマウスの脳を切り抜きます:ドロップダウンメニューから「切り抜き」を選択し、画像の境界をドラッグして、脳幹の下のマウスの頭を切り抜きます。上記のように「手動3D方向変更」機能を使用してPET画像とCT画像の向きを変更し、頭蓋骨がすべての寸法でまっすぐになるようにします。

6.インターフェースの左上にある[データの追加]ボタンを使用して、そのマウスのMR画像(DICOM形式)をロードします。「手動3D方向変更」を使用してMRを動かし、CT画像内の頭蓋骨に合わせます(すべてのモダリティが同じ向きであることを確認してください)。

7. 「3D ROIツール」を使用して、MR画像にストロークROIを描画します。

1. ビジュアルコントローラータブ(VC)でPETビジュアライゼーションの選択を解除してオフにし、MRとCTのみを使用してROIを描画します。

2. 「ROIを追加」ボタンをクリックして新しいROIを作成し、「influct」と名付けます。「スプラインツール」を選択し、左クリックしてROIの境界線を描画し、右クリックして閉じます。

3. ストロークを囲むすべてのスライスを繰り返し、ROIで頭蓋骨をキャプチャしないようにし、ベストプラクティスは頭蓋骨の境界とストロークROIの間にボクセルギャップを残すことです。

8.梗塞ボリュームを使用して対側ROIを生成します。

1. 新しいROIを作成し、「対側」のラベルを付けます。Infarct ROIを右クリックし、「エクスポート」を選択します。ROI を 2 の位置 (「Inp1」) にドラッグします。

2. 「Inp1」のみを選択した状態で、「向き変更/登録」メニュー内の「オペレーター」機能で左右反転します。「ROI」ボックスにチェックを入れ、「表示のみ」を選択し、新しいROIを反対側の同じ領域に手動で移動します。「算術」演算子を選択し、新しい ROI に 2 のスカラー乗算を適用して、ROI の独立した定量化を可能にします。

3. 3D ROIツールに戻ります。「エキスパートおよびエクスペリメンタル」タブに移動し、「ROIのインポート」ボタンをクリックします。ダイアログボックスからInp1を選択し、新しいボリュームを反対側のROIとして読み込みます。

9.平均的なPET画像を右クリックしてアンロードし、PETを再びオンにします。3D ROIツール内の「結果のエクスポート」アイコンを使用して、定量的な取り込み結果を生成します。

10.必要に応じて、追加のスプリットブレイン解析を実行します(つまり、Vivoquantソフトウェア用の3Dマウスブレインアトラスプラグインモジュールを使用して、右脳半球と左脳半球領域の自動ROI生成)。

1. 登録したPET/CT画像を再読み込みします。

2.「高度なモジュール」メニューをクリックし、3D脳地図ツールを選択して、マウス脳地図帳をインポートします。「詳細設定」で「すべての地域左/右」を選択し、「実行」をクリックして3Dアトラスをインポートします。

3.頭蓋骨を境界として使用して、アトラスを脳内に手動で適合させます。

4. アトラスを再実行し、[3D ROI のインポート] がオンになっていることを確認して、14 の左右半球 ROI (髄質、小脳、中脳、橋、皮質、海馬、視床、視床下部、線条体、淡蒼球、嗅球、脳梁、白質) すべての結果のスプレッドシートを生成します。

11.スキャナー操作ソフトウェアを使用して、脾臓でのトレーサーの取り込みを定量化します(Table of Materialsを参照)。

1. PETおよびCT画像ファイルをデータベースで強調表示し、「一般解析」をクリックしてロードします。

2. 登録タブをクリックし、「硬質登録」アイコンをクリックしてPET画像とCT画像を同時登録します。

3. ROI定量化タブをクリックし、「ROIの作成」アイコンをクリックして、脾臓と名付けます。

4.「球体」ツールを選択して、参照用のCTファイルを使用して脾臓のROIを描画し、腎臓の取り込みと重複しないことを確認します(腎臓からの波及を避けるためにPET画像と信号を使用します)。

5. ROIを編集して、動物間のROI量を一定に保ちます。

12.取り込み正規化の標準補正値を計算します。

1. 標準スキャンからPET/CTデータをロードし、「手動3D ROI」ツールを使用して20mLシリンジを含むシリンダーROIを作成します。

2. スプレッドシートのアイコンを使用して、規格に含まれる放射能のレベルを取得します。

3. このnCi/ccの結果と、標準試料に対して記録された元の放射能(すなわち、nCi/cc単位の標準試料の線量キャリブレータ測定)を使用して、PET取り込み値の補正係数を作成します。すなわち、線量校正器によって記録された標準の放射能を、標準のPET画像から計算された放射能で除算します。

13.線量活性と測定時間を使用して、すべてのマウスのPET取得時間に正しく減衰します(つまり、PETスキャンの開始時の線量活性を計算します)。

14.残差値についても繰り返し、崩壊補正線量から差し引いて、各動物が受けた正確な活動を計算します。

15.この減衰補正を適用した後、標準補正も適用して、データが正しいアクティビティレベルにあることを確認します。これらの補正が手動で描画されたROI結果、およびdMCAO位置に関連する脳領域(つまり、皮質、海馬、線条体)の脳アトラスROIデータに適用されていることを確認します。

16.次の式を使用して、すべてのROIの%ID/gを計算します:%ID/g =(nCi/cc単位のROI放射能/nCi/ccで受け取った崩壊補正線量)x100。グラフ化ソフトウェアを使用して、各ROIの時間活動曲線を生成するために、時間の関数として%ID/gをプロットします。

17.スキャナーソフトウェアを使用して、最終的な画像の視覚化と図の生成を行います。スキャン時に各マウスが受け取った減衰補正線量に従って画像を正規化し、すべての画像が同じ%ID/gスケールになるようにします。

注: これは、異なるマウスからの画像および/または異なる日に行われた研究からの画像を正確に比較するために必要です。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Inveon PET/CTスキャナー	Siemens	バージョン4.2
VivoQuant ソフトウェア	InVicro	バージョン2.5	画像解析ソフト
Inveon Research Workspace ソフトウェア	Siemens	バージョン4.2	スキャナー操作ソフト。後処理管理ソフトウェアであるmicroQViewが含まれています
Dose calibrator	Capintech		CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
butterfly カテーテル	SAI Infusion Technologies	BFL-24	27.5 G 針
1 mL シリンジ	BD
インスリン注射器	BD	329461	0.5 mL インスリン注射器と針
20 mL シリンジ	VWR	BD302831	BD シリンジ スリップ チップ 卒業
ティッシュ接着剤	Santa Cruz Animal Health	sc-361931	3 mL
ヒートランプ	Fluker	27002	5.5" 爬虫類ヒートランプ、クランプとスイッチ付き
0.9% 滅菌生理食塩水	Pfizer	00409-4888-10	0.9% 注射用塩化ナトリウム、10mL
Chux 吸収シート	ThermoFisher Scientific	1420662	使い捨て吸収性パディング
アイリスハサミ	World Precision Instruments	503708-12	11.5cm, ストレート, 12パック
外科用テープ	3M Durapore	1538-0	1/2"X10ヤードロール、シルク、低アレルギー性
マウス PET ベッド	社内		4 マウス PET ベッド
lighter	Bic	UDP2WMDC
Isoflurane	ヘンリー・シャイン	NDC 11695-6776-2	Isothesia, 吸入麻酔薬, 250 mL
Oxygen	Praxiar	UN1072	Compressed gas
目の潤滑剤	ワトソンラグビー	PV926977	Artificial Tears Lubricant Eye 軟膏, 1/8 oz