1. 細胞の調製
資格のあるサプライヤーから細胞株を入手してください。 注: 目的の細胞株の細胞が、培養培地で、または基質(マトリゲルのような基底膜マトリックス)の助けを借りてスフェロイドを形成できることを確認します。文献を調べるか、事前実験を1ラウンド行って確認します。 細胞株の供給者が提供する特定の手順に従って、凍結細胞を解凍します。一般的な手順は他の場所にあります。 25cm 2 培養フラスコで1〜2継代の細胞を培養します。その後、細胞は3D細胞培養に使用する準備が整います。 細胞の健康状態を毎日監視し、標準的な条件(37°C、5%CO 2 、湿度95%)で細胞をインキュベーターに維持します。必要に応じてメディアをリフレッシュします。 注: 培養培地は、ダルベッコ修正イーグル培地 (DMEM) (4.5 g/L グルコース)、1% 抗生物質 - 抗真菌薬、および 10% ウシ胎児血清 (FBS) で構成されています。細胞が培養フラスコで合流する前に細胞を継代培養します。サプライヤーが提供する細胞培養ガイドラインに従ってください。一般的な手順は他の場所にあります。 マルチウェルプレートで3D細胞培養を以下の一般的なプロトコールに基づいて行います。 培養液を培養フラスコから取り出し、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水(PBS、37°Cに加熱)で洗浄します。 トリプシンエチレンジアミン四酢酸(EDTA、0.5%)1 mLをフラスコに3分間加えて、細胞を再懸濁します。次に、トリプシンを希釈するために培地を追加します。 細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移し、500 x g および室温で5分間遠心分離します。 上清を取り除き、予め温めた培地4 mLで細胞を再懸濁します。サンプルの1滴を血球計算盤にピペットで移し、細胞数を計数して細胞濃度を測定します。播種に適した濃度( 、例えば 、3,000細胞/mL)に細胞を希釈します。 注: 各細胞株および各タイプのマルチウェルプレート(96ウェル、384ウェル、または1536ウェル)について、スフェロイドの初期細胞濃度を最適化します。 細胞を超低接着(ULA)丸底マルチウェルプレートに播種します。各ウェルに200 μLの細胞懸濁液を3,000細胞/mLの濃度で加え、各ウェルに約600個の細胞が含まれるようにします。 室温(RT)で、播種直後にプレートアダプターを使用してプレート全体を7分間遠心分離し、350 x g の速度または利用可能な最低速度で遠心分離します。 注: 遠心分離機は、細胞をウェルの中心に集め、単一の均一なスフェロイドの形成を促進します。遠心分離ステップは、腫瘍スフェロイドを形成するために最初に1回だけ実行されます。腫瘍スフェロイドが成長し始めると、それは繰り返されません。 マルチウェルプレートを培養インキュベーターで37°C、5%CO 2 に維持し、3日ごとに培地をリフレッシュします。 注: 成長時間は、3D培養条件によって異なる場合があります。私たちの研究では、96ウェルプレートのU-87 MG細胞株とHCT 116細胞株の両方に3,000細胞/mLが使用されているため、HCT 116細胞の場合、スフェロイドは4〜7日で~500 μmまで増殖できます。一般的な3D培養プロトコルに基づいて、さまざまなスフェロイドモデルに培地サプリメントと成長因子を追加することを検討してください。 腫瘍スフェロイドの光干渉断層撮影法(OCT)イメージングを3〜3日ごとに実施し、腫瘍スフェロイドの成長を縦断的に研究します。 注: OCTイメージングの推奨時点は、4日目、7日目、11日目、14日目、18日目、21日目です。 2. ハイスループットOCTイメージングプラットフォーム
注: 図1 を参照してください。
腫瘍スフェロイドイメージング用のOCTシステムに適した広帯域光源を選択してください。 注: ここでは、中心波長が~1,320 nm、帯域幅が 110 nm の超発光ダイオード (SLD, Figure 1A , B ) を広帯域光源として使用しました。 回路図に従ってOCTシステムのリファレンスアームとサンプルアームを構築します(TAG_240 TAG_239 TAG_238図1A 、 B Table of Materials は、OCTシステムの構築に必要な光学部品をリストアップしています。リファレンスアームとサンプルアームの光路長が密接に一致していることを確認してください。 OCTの分光器設計の詳細については、コリメータ、グレーティング、Fシータレンズ、ラインスキャンカメラなどの分光器を構築します(セットアップについては 図1C を参照してください)。または、光源の中心波長に一致する市販の分光器を選択します。分光器がレーザー帯域幅全体をカバーし、高い光子収集効率を達成し、干渉パターンのゆっくりとしたウォッシュアウトを提供するように正しく配置されていることを確認してください。 サンプルアームのパワー、総イメージング深度、深度依存感度、軸方向分解能、焦点深度、横方向分解能などの指標を含むOCTシステムのパフォーマンスを特徴付けます。弱い反射板( など 、NDフィルター付きミラー)をサンプルとして配置し、深さ依存の感度、軸方向の分解能、焦点深度を測定します。横方向の解像度を確認するためのサンプルとして、米国空軍(USAF)の解像度テストチャートターゲットを配置します。 マルチウェルプレートを水平方向に動かして、さまざまなウェルの腫瘍スフェロイドを画像化するための電動トランスレーションステージを選択します( 図1B を参照)。移動範囲が108 mm x 72 mmを超えるステージを使用して、マルチウェルプレートのすべてのウェルを完全にスキャンします。ソフトウェア制御を備えた2次元(2D)または3次元(3D)の電動翻訳ステージを使用して、各ウェルの正確な位置を特定し、OCTシステムの自動化によりハイスループットイメージングを実現します。 プレートアダプターを使用するか、プレートホルダーを設計(3Dプリント)して、マルチウェルプレートを固定位置に保持します。 OCTイメージングを行う前に、2D傾斜ステージと並進ステージに取り付けられた回転ステージ( Figure 1D を参照)を使用してマルチウェルプレートの傾きと回転を補正し、異なるウェルからの焦点面のばらつきを最小限に抑えます。OCT画像で相対的な位置を監視するときは、D2、D11、B6、D6、およびG6をガイドウェルとして使用します( 図1A )。 プレートの回転を調整して、エッジがステージの移動方向と平行になるようにし、OCT画像でウェルが同じ水平位置に留まるようにします( 図1E )。OCTイメージングのためにウェルが同じ垂直位置に留まるように、光学テーブルと平行になるようにプレートの傾きを調整します( 図1F )。 注: 傾斜角度とフォーカスの調整は、すべてのウェルのOCT画質を最適化するのに役立ちます。しかし、ウェルごとに異なる培地の高さが異なると、光路が変化し、スフェロイド像の焦点がぼける可能性があります。オートフォーカスを実装して、OCTイメージングの焦点面を制御し、最適化された画質を実現できます。調整ステップは、次の問題による腫瘍スフェロイドのOCT画質の低下を解決しません:初期播種位置によるスフェロイドの偏心;バイオファブリケーションされた細胞外マトリックスに埋め込まれた場合のスフェロイドの上昇。プレートの品質が悪く、ウェルボトムの高さに大きなばらつきがあります。オートフォーカスまたはセルフアライメント機能を備えた追加のソフトウェア制御を実装して、OCTイメージングシステムの性能を最適化できます。 各ウェルからデータを順次収集するために、カスタムコンピュータプログラムがOCT画像取得とステージ移動を制御します。 3. 腫瘍スフェロイドのOCTスキャンと処理
腫瘍スフェロイドのOCTイメージングの日に、マルチウェルプレートをインキュベーターから取り外します。OCTイメージングシステムの下に移し、プレートアダプターの上に置きます。 注: 腫瘍スフェロイドのOCTイメージングは、ポリスチレンプレートの蓋をオンまたはオフにして行うことができます。しかし、井戸からの蒸発による蓋の水の結露は、光の透過に影響を与え、光の経路を歪め、回転楕円体からの最適なOCT画像が得られない可能性があります。 並進ステージのz方向に沿って移動して、プレートの高さを調整します。焦点面の位置を各回転楕円体の上面から 100 ~ 200 μm 下に維持し、深さ方向の焦点プロファイルが不均一になることの影響を最小限に抑えます。 カスタムソフトウェアでは、腫瘍スフェロイドの発生段階に応じて、腫瘍スフェロイド全体をカバーするように適切なOCTスキャン範囲( {{TAG_406}TAG_409 TAG_408 TAG_407}、1mm×1mm)を設定します。 パラメータの保存 をクリックして設定を保存します。 カスタムソフトウェアを使用して、スフェロイドを含むプレートのすべてのウェルについて、腫瘍スフェロイドの3D OCT画像を1つずつ取得します。 Preview ボタンをクリックしてプレビュー画像を表示し、 Acquire 」ボタンをクリックしてOCT画像を取得します。 注: ステージが動いていないときにOCTスフェロイドデータが収集されていることを確認してください。回転楕円体は通常、U底ウェルの中心にあります。しかしながら、スフェロイドは、培養培地中のスフェロイドの慣性によりステージが加速または減速しているときに、培養培地中でシフトしてもよい。 腫瘍スフェロイドの3D OCTデータセットを処理し、カスタムC++処理コードでOCT構造画像を生成します。OCT データの後処理のフローチャートについては、 図 2A を参照してください。 注: 生成された 3D OCT 構造イメージについては、 Figure 3A を参照してください。 3 次元すべてのピクセル サイズをキャリブレーションします。OCT構造イメージを補正されたスケールで再スケールします。 注: OCT画像の軸方向(z方向)の距離は、参照アームとサンプルアームの間の光路差を測定します。したがって、再スケーリングのために軸方向のピクセルサイズを較正する際には、サンプルの屈折率(n)を考慮する必要があります。私たちの研究では、腫瘍スフェロイドの屈折率としてn = 1.37を使用します。 2D OCT イメージを使用して、回転楕円体の重心を横切る 3 つの断面 XY、XZ、YZ 平面で回転楕円体のイメージのコラージュを生成します。回転楕円体の画像のコラージュの代表的な出力については、 図 4C–E を参照してください。MATLAB 関数 dftregistration を使用して、すべての回転楕円体のイメージ レジストレーションを実行し、すべての回転楕円体の重心がほぼ同じ位置に配置されていることを確認します。 商用ソフトウェアまたはカスタムソフトウェアを使用して、回転楕円体の3Dレンダリングを取得します。 NOTE: 次の手順は、市販のソフトウェアを使用して腫瘍スフェロイドの3Dレンダリングを取得する方法を示しています。 3D OCTデータをソフトウェアにロードします。 Surpass パネルをクリックします。次に、 Add New Volume をクリックします。3D レンダリングに使用する Blend モードを選択します。 マウスポインタを使用して画像をドラッグして、表示角度を調整します。 4. 3D腫瘍スフェロイドの形態学的定量
注: MATLABのカスタムコードがこの定量化を処理します。 Run ボタンをクリックしてプロセスを開始します。スフェロイドの形態学的定量化のステップのフローチャートについては、 図 2B を参照してください。
スフェロイドの直径、高さ、および直径に基づく体積を定量化します。 回転楕円体の重心を横切る 3 つの断面 XY、XZ、YZ 平面で 2D OCT イメージを選択します。 回転楕円体の直径と高さをそれぞれXY平面とXZ平面で測定します。 腫瘍の球形を推定して、 {{}}を使用して、直径ベースの回転楕円体体積を計算します。
ボクセルベースのスフェロイド体積を定量化します。 スフェロイドのOCT構造データに3D平均化フィルターを適用して、スペックルを除去します。 キャニーエッジ検出フィルターを使用して、腫瘍スフェロイド領域をウェル底から適切な閾値でフレームごとにセグメント化します。 3D データ用の結合ボクセルをグループ化します (組み込み関数: bwconncomp を参照)。 グループ内の各結合ボクセルと回転楕円体の重心 (手動で選択) との間の平均距離をグループごとに計算します。スフェロイド領域を、平均距離が最小のグループとして識別します。 回転楕円体領域内のボクセルの数を数え、次に個々のボクセルの実際の体積 (体積/ボクセル) を掛けて、回転楕円体の合計体積を求めます。 5. 3D腫瘍スフェロイドの死細胞領域検出
注: 均質な媒体では、深さの関数として検出されるOCT後方散乱強度( I （ z ))の関数として検出されます。ランベルトベールの法則:
ここで、 z は深さ、 μ は光学減衰係数、 I0 はサンプルへの入射強度です。したがって、導出された光学減衰係数は次のように表すことができます:
OCT画像は対数スケールでプロットされることが多いため、OCT強度プロファイルの傾きを取得して光学減衰係数を導き出すことができます。光減衰マップの生成フローチャートについては、 図 2C を参照してください。
セグメンテーションを実行して、回転楕円体の外側の不要な領域を削除します。3D 平均フィルターを実行して、OCT イメージに固有のスペックル ノイズを抑制します。 特定の深度範囲 (移動ウィンドウ) で対数スケールの OCT 強度プロファイルを線形近似し、その傾きを抽出し、傾きに -1/2 を掛けることにより、ピクセル単位の光学減衰係数を取得します。 注: セグメント化された回転楕円体領域内の各ボクセルの減衰係数は、10 ボクセルの深さウィンドウ (深さ ~40 μm) の OCT 強度プロファイルの傾きに基づいて計算され、ボクセルはウィンドウの中央に配置されます。 上記の方法(ステップ5.1および5.2)を、セグメント化されたスフェロイド領域を含むフレーム内の各軸スキャンおよび3Dデータセット内の各フレームに適用し、セグメント化されたスフェロイド領域のすべてのボクセルの光学減衰係数が計算されるまで適用します。 バイナリしきい値処理を実行して、高減衰領域を強調表示します。 元の画像で二値化された光学減衰マップを強調表示して、デッドセル領域にラベルを付けます (ブレンディング)。ブレンドされた減衰マップの 3D レンダリング イメージを生成して、デッド セル領域の 3D 分布を視覚化します。 
