マウス脳における脳海綿状奇形病変の造影マイクロCTイメージング

要約

出典: Choi, J. P. et al. マウスモデルにおける脳海綿状奇形の誘導およびマイクロCTイメージング。 J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、マイクロCTイメージングを使用してマウス脳の脳海綿状奇形(CCM)病変を視覚化する方法を示しています。サンプル調製、イメージング、および3D画像再構成の手順を詳しく説明し、脳組織におけるCCM病変の密度と位置を評価します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.マイクロコンピュータ断層撮影(CT)スキャンのサンプル調製

1. 二酸化炭素窒息によりP8で新生児の子犬を安楽死させます。
2. 10 mLシリンジ中のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に3 mLの2%パラホルムアルデヒドを入れた29ゲージの針をマウス心臓の心室に挿入して、心臓内灌流を行います。
   注意: パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な保護具を着用してください。
3. ハサミを使って頭を体から取り外します。ハサミで頭の皮膚をすべて取り除き、鉗子で頭蓋骨を剥がして脳全体を解剖します。
4. 実体顕微鏡で、倍率7.82倍、ゲイン1倍、ガンマ0.6、露光時間20msで脳の画像を撮影します。
5. 解剖した脳をPBS溶液中の4%パラホルムアルデヒドで一晩固定します。
   注意: パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な保護具を着用してください。
6. 翌日、鉗子を使用して後脳を剥離し、PBS溶液で洗浄します。
7. 後脳をルゴールのヨウ素溶液で48時間インキュベートします。
8. インキュベーション後、後脳を短時間風乾させて余分なルゴールのヨウ素溶液を取り除きます。
9. ヨウ素で染色したルゴールの後脳を0.65 mLの微量遠心チューブに詰め、組織の収縮を防ぐためにプラスチックパラフィンフィルムで完全に密封します(図1A)。
10. 微量遠心チューブをスポンジ付きの5 mLプラスチックチューブに入れて、スキャン中に微量遠心チューブが動かないようにします(図1B)。

2.マウス脳の脳海綿状奇形(CCM)のマイクロCTスキャン

1. マイクロCTシステムのアルミニウムホルダーにチューブに詰められた後脳を垂直にマウントします。
2. スキャニングパラメータを540投影と2秒の露光時間に設定し、ソース条件を50kVと10Wにして、断層撮影データセット(画像解像度9.5μm/ピクセル)を取得します。
3. スキャンからのX線写真は、マイクロCTシステムが提供するハードウェアベースの投影再構成ソフトウェアによって自動的に再構築され、16ビットの軸方向スライスの画像シリーズ(「TXM」ファイル)が生成されます。

3.マイクロCTデータセットの解析

1. 再構成した画像ファイル(TXM)を3次元解析ソフトウェアで開き、「ボリュームレンダリング」機能で脳を可視化します。
2. 「バウンディングボックス」と「クリッピングプレーン」機能を使用して、後脳を目的の方向に変換します。
3. 変換されたイメージを拡張モードでリサンプリングし、ボクセル サイズを保持します。
4. 変換された画像(3.3)に「新しいラベルフィールドの編集」を作成し、グレースケールの強度を使用して後脳のみを強調表示します。
5. 強調表示された領域を追加し、「ラベル分析」を実行して、後脳全体の測定値を取得します(、つまり、総体積と面積)。測定値をExcelファイルにエクスポートします。
6. 「等値面レンダリング」機能を使用して後脳を視覚化します。
7. 変換された画像に別の「新しいラベルフィールドの編集」を作成し、グレースケールの強度を使用して病変のある領域を強調表示します。
8. 強調表示された領域を追加し、「ラベル」分析を実行して、後脳内の病変の測定値を取得します(、つまり、総体積と面積)。測定値をExcelファイルにエクスポートします。
9. 「generate surface」および「surface view」機能を使用して病変を視覚化します。
10. 後脳の画像を目的の向きでスナップショットしたり、病変の3D視覚化のためのムービーを生成したりします。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4-hydroxy tamoxifen	Sigma-Aldrich	H6278	Cdh5-CreErt2
コーン油	Sigma-Aldrich	C8267-500ML<
Stereomicroscope	Leica	M205FA	巨視的な画像を撮影するには
Lugol's Iodine solution	Sigma-Aldrich	L6146	コントラストマイクロCTのサンプルを染色するには<
プラスチックパラフィンフィルム	Parafilm	PM992	To packagesamples
Micro-CT	Xradia	MicroXCT-400<
3Dレンダリングソフトウェア	FEI Visualization Science group	Avizo 3D画像処理ソフトウェア	マイクロCTスキャンの解析

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