分化したオリゴデンドロサイトを同定するためのデュアル蛍光イメージング

要約

出典:Schott, J. T., et al.Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオでは、ラットの仔の脳から単離された前駆細胞(OPC)からのオリゴデンドロサイトの分化を評価するために、デュアル蛍光イメージングを使用する方法を示しています。このプロセスには、細胞の固定、一次抗体および蛍光色素標識二次抗体による特異的マーカーの標識、蛍光イメージングによる細胞の可視化が含まれます。ミエリン塩基性タンパク質(MBP)とオリゴデンドロサイト転写因子2(Olig2)の両方を発現する分化オリゴデンドロサイトが同定され、Olig2のみを発現する未分化前駆細胞と区別されます。

プロトコル

1. アッセイプレート、ストック溶液、OPCベースメディアの準備

Note: ここで説明するラットOPCベース(Sato)培地は、以前に発表された研究から得られたものです。代替培地製剤もこの手順に適合し得る。

1. poly-L-lysine (PLL) を滅菌脱イオン水で 10 μg/ml の濃度に再懸濁してください。希釈したPLLを400μlを、黒壁の透明な底の24ウェル組織培養用ディッシュの各ウェルにピペット
で入れます。
2. 組織培養皿を37°Cの組織培養インキュベーターで2時間、または4°Cの冷蔵庫で一晩コーティングします。
3. めっきの少なくとも20分前に、コーティングされた皿からPLLを吸引します。残りのPLLをウェルから乾かすには、蓋を部分的に半開きにして24ウェルプレートを組織培養フードに置きます。分離されたOPCをめっきする前に、ウェルが完全に乾いていることを確認してください。液体PLLが存在するプラスチックには細胞が付着しません。
4. 準備N-アセチル-L-システイン(NAC)原液(1,000倍):100mg溶解N-アセチル-L-システイン (NAC) を 20ml のダルベッコ修正イーグルス培地 (DMEM) に。分注して-20°Cで保存します。
5. ヒドロコルチゾン原液(1,000倍)を調製する:ヒドロコルチゾン1mgにエタノール1mlを加え、渦巻いて溶解します。19 mLのDMEMを加え、溶液を混合し、分注し、-20°Cで保存します。塩基培地へのヒドロコルチゾンの添加は、グリア細胞の生存を促進することが示されています。
6. d-ビオチン原液(5,000倍)を調製する:d-ビオチン2.5mgをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)50mlに溶解する。0.1 N NaOHを1-2 x 5 μl滴加えて溶解を助けます。分注して-20°Cで保存します。
7. インスリン原液(100倍)を調製する:25mgのインスリンを50mlの組織培養グレードの水に溶解します。1 N HClを250 μl加え、溶液が透明になるまで混合します。0.22 μmフィルターで滅菌し、4°Cで最大6週間保存してください。
8. 佐藤ストック溶液(100倍)を準備します：<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
9. プロゲステロンストック溶液(25 μg/μl)を準備します：100 μlのエタノールに2.5 mgのプロゲステロンを溶解します。
10. 亜セレン酸ナトリウム原液(400 ng/μl)を調製する:4 mgの亜セレン酸ナトリウムを0.1 N NaOHの100 μlに溶解します。DMEM10mlを加えて混ぜます。
11. DMEM100mlにヒトアポトランスフェリン1g、ウシ血清アルブミン1g、プトレシン160mgを加えて混合し、完全に溶解させる。プロゲステロン原液25μl、亜セレン酸ナトリウム原液1,000μlを加えて混合します。分注して-20°Cで保存します。

OPCベース培地の調製:DMEM100 mL(4.5 g/L D-グルコース、L-グルタミン、および110 mg/Lピルビン酸ナトリウムを含む)あたり、NAC 100 μL、ヒドロコルチゾン100 μL、d-ビオチン20 μl、インスリン1 ml、佐藤ストック1 ml、微量元素B100 μL、B-27サプリメント2 mL(50倍)、およびペニシリン/ストレプトマイシン1 ml(100倍)を加えます。0.22 μmフィルターで滅菌し、4°Cで保存します。

血小板由来成長因子AA(PDGF-AA)原液(1,000倍):PBS12.5mlに250μgを0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)と共に溶解し、20μg/ml溶液を作製する。分注して-80°Cで保存します。

OPC増殖培地を調製する:OPCベース培地に20 ng/ml PDGF-AAを添加します。

OPC分化培地を調製する:OPC塩基培地に45 nMトリヨードチロニンを添加。

カラムバッファーの調製:PBS500 mLにBSA2.5 gと0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)2 mLを加え、pHを7.2に調整します。0.22 μmフィルターで滅菌し、4°Cで保存します。

2. 4%パラホルムアルデヒドによるOPCの分化と固定の誘導

Note: オリゴデンドロジェネシスに対する低分子化合物の影響を試験する際には、薬物をジメチルスルホキシド(DMSO)に定期的に溶解して1,000倍のストックを調製し、これを-80°Cで保存し、SATO培地に直接希釈して最終濃度0.1%のDMSOを得ます。この濃度のDMSOを使用しても、OPCの増殖または分化に変化は観察されていません(データは示されていません)。

1. OPCベースメディアを37°Cまで温め、薬物治療ストックを室温まで解凍します。治療を重複して行う場合は、1.5mlのチューブに治療群ごとに約1.25mlの培地を調製します。トリプリケートサンプルの場合は、2 mLの容量の遠心分離チューブを使用して、たるみを考慮します。
2. リピートウェル用の処理マスターミックスを調製するには、処理ストックを直接OPCベース培地に希釈します。各マスターミックスを短時間ボルテックスまたは穏やかに混合して、処理の均一な分布を確保します。
3. 45 nM トリヨードチロニンを準備します (T₃) ポジティブコントロールとして、適切な車両をネガティブコントロールとして。10 mM T₃ストックし、必要に応じてトリートメントマスターミックスでさらに希釈してDMSOの最終濃度を下げます。
4. 細胞の乾燥を避けるために、一度に1つの処理グループで培養井から培地を吸引します。ガラス製パスツールピペットの端に200 μlのピペットチップを使用して、ウェルの側面から黒い物質が離れて培養物に混入
しないようにします。
5. 1 mLのピペットを使用して、ウェルの側面に沿って500 μlの治療マスターミックスをゆっくりと加えます。
6. 培養物を所望の期間インキュベートし、2〜3日ごとに新鮮な処理培地との完全な培地交換を行います。私たちは日常的に30-40%のMBP⁺文化差別化メディア。
7. 希望する処理期間の終わりに、新鮮な4%パラホルムアルデヒド(PFA)を準備するか、冷凍ストックを室温まで解凍します。CAUTION:PFAは非常に毒性が高いため、ドラフトで調製する必要があります。
8. 培地を吸引し、ウェルの側面に400μlのPFAをゆっくりと加えて細胞を固定します。プレートを室温で20分間インキュベートします。
9. PFAを吸引し、無菌のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS、Ca²⁺とMg²⁺)細胞を洗うために井戸の側面に。さらに合計2回洗濯を繰り返します。最終洗浄を吸引しないでください。
10. プレートをパラフィルムで包み、後で処理するために4°Cで保存するか、次のステップに直接進みます。プレートは数週間保存できます。

3. 免疫細胞化学とミエリン塩基性タンパク質の定量

化

Note: 24ウェルプレートでリキッドハンドリング手順を実行するときは、細胞の乾燥を避けるために迅速に作業することをお勧めします。ここでは、マルチチャンネル真空吸引器とマルチチャンネルピペットの使用をお勧めします。

1. プレートを室温に戻して、ウェルを吸引し、250μlのD-PBSを追加してください（Ca²⁺ and Mg²⁺) 0.1% Triton X-100 と 5% の正常なヤギ血清 (NGS) が含まれています。プレートを室温で1時間インキュベートし、眼窩を穏やかに振とうします。
2. マウスモノクローナル抗MBP抗体1:1,000とウサギポリクローナル抗アクチン抗体1:200をD-PBSで希釈して一次インキュベーション溶液を準備します（Ca²⁺ and Mg²⁺) 5% NGSを含みます。あるいは、1:1,000のウサギポリクローナル抗Olig2を、混合グリア培養におけるオリゴデンドロサイト特異的な標準化に使用できます。ウェルあたり250 μlを収容するのに十分な一次溶液を調製します。
3. 一次抗体を4°Cで一晩16〜18時間インキュベートし、眼窩を穏やかに振盪します。
4. 一次インキュベーション溶液を吸引し、細胞を500μlのD-PBSで3 x 10分間洗浄します（Ca²⁺とMg²⁺) 室温で穏やかに軌道を揺らします。
5. プレートを洗浄しながら、D-PBSで抗マウス680抗体と抗ウサギ800抗体を1:500に希釈して二次インキュベーション溶液を準備します（Ca²⁺ and Mg²⁺) 5% NGSを含みます。この溶液を調製するときは、周囲光への曝露を最小限に抑えてください。
6. 最終洗浄液を吸引し、250μlの二次インキュベーション溶液を加えます。プレートを光から保護し、室温で1時間インキュベートし、眼窩を穏やかに振盪します。
7. 二次インキュベーション溶液を吸引し、500μlのD-PBSでウェルを3×10分間洗浄します（Ca²⁺とMg²⁺) 室温で穏やかに軌道を揺らします。
8. 700 nmおよび800 nmの蛍光発光を検出できるイメージングシステムを使用してプレートをスキャンします。まず、焦点オフセットを 3 に、感度を MBP の場合は 1.5、Actin の場合は 5.0、Olig2 の場合は 3.5 に設定します。必要に応じて感度値を調整して、信号の露出過多を防ぎます。
9. 半自動ソフトウェアベースの方法を使用して、オリゴデンドロジェネシスの程度を定量化します。
   1. ソフトウェアを使用して、プレート分析モードを「24ウェル」に設定し、スキャンしたウェルの外周に円を揃えます。ノーマライゼーションチャンネルを「800」に設定し、700 nm(MBP)および800 nm(Olig2/Actin)チャンネルの合計蛍光強度と相対蛍光強度をエクスポートします。
   2. 700 nmの強度を800 nmの強度で除算して、相対蛍光単位で正規化されたMBP発現を求めます。反復測定値の平均を計算し、解析の必要に応じて式を Day 0 +PDGF コントロールにスケーリングします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/mL
ジメチルスルホキシド	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 mL
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
クレマスチンフマル酸塩salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
クエチアピン半フマル酸塩	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/mL
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/mL
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/mL
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/mL
亜セレン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/mL
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/mL
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/mL
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/mL
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/mL
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/mL
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1 x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1 x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1 x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1 x
24-well 蓋付き黒の可視プレート	Perkin Elmer	1450-605<
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoclonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1000 希釈
rabbit polyclonal anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
ウサギポリクローナル抗オリグ2	Millipore	AB9610	1:1000 Dilution
ヤギのアンチマウス680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
ヤギ anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:000 dilution
Alexa Fluor 488 ヤギ anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:000 希釈
DPIでゴールドのアンチフェードを延長	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor

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