表皮内神経線維内のミトコンドリアの可視化

出典:ハミド、H.S.、他.Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intradermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (2017)

}このビデオでは、3次元イメージングを使用して神経特異的なミトコンドリアを視覚化する方法を実演しています。これは、事前に標識された表皮内神経線維の逐次スキャンを取得し、神経構造に関連するミトコンドリアを分離して表示するための3D表面画像を生成するプロセスの概要を示しています。

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 共焦点イメージング

共焦点イメージングを実行します:
1. 倒立顕微鏡で40倍油浸(1.25開口（N.A.))対物レンズを搭載したレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して画像を収集します。
  1. 各焦点面で、蛍光シグナルを順次取得します:
    核:励起λ= 405 nm、スペクトル発光フィルターλ= 420 - 480 nm
    神経線維:励起λ= 488 nm、スペクトル発光フィルターλ= 505 - 560 nm
    ミトコンドリア: 励起 λ = 543 nm、スペクトル発光フィルター λ= 606 - 670 nm
2. 次のスキャンパラメータを顕微鏡ソフトウェアに入力します:スキャンレート600 Hz、2フレーム平均化、ズーム2.2。12ビット強度の解像度(4096グレーレベル)。
  1. 顕微鏡ソフトウェアを、横方向の分解能(スキャン分解能 = 1,024 x 1,024)と軸方向分解能/光学切片化(共焦点開口 = 1 エアリーユニット(AU)、Zステップサイズ210 nm)に最適化して設定します。
    注: 結果として得られるXYZ解像度は172.2 nm x 172.2 nm x 210 nmで、画像サイズは176.1 μm x 176.1 μm x 30-50 μmです。
3. 神経信号(緑色蛍光)のライブスキャンをアクティブにし、Zフォーカスコントロールは、組織切片内の神経信号を包含する顕微鏡ソフトウェアの上部と下部の焦点面を見つけて設定します。合計z範囲は、50μmの組織切片で通常30〜50μmです。
4. ライブスキャン中に顕微鏡ソフトウェアでスキャンフィールドを回転させ、表皮が画像内で水平または垂直に配置されるようにします。
5. 各信号を別々にスキャンし、検出器(光電子増倍管、PMT)の電圧とオフセットを調整して、飽和度の高いピクセルと飽和不足のピクセルを最小限に抑えます。
  注: 上記のパラメータでのスキャン時間には、zスライスの数にもよりますが、約20〜40分かかります。

2. 3D ヒト表皮内神経線維内のミトコンドリアの可視化と解析

3D表皮を分離します:
1. 元の画像を複製し、画像の最大強度投影(拡張フォーカスビュー)を使用して表皮を特定し、分離します。
2. 関心領域ツールを使用して表皮の上端と下端に沿ってトレースし、表皮内神経線維に存在しない角質層や真皮などの不要な領域を取り除きます。この選択に合わせて切り抜きます。
神経とミトコンドリアの蛍光シグナルにデコンボリューションを使用します:
注: デコンボリューションは、蛍光シグナルの完全性を回復するのに役立ちます。このプロトコルで使用される復元は、画像内の蛍光シグナルを使用して、シグナルが元のソースからどれだけ広がるかを決定するため、ブラインドデコンボリューションと呼ばれます(点拡散関数)。このプロセスでは、信号の広がりを元の位置に再割り当てすることで、信号の分解能が向上します。
1. 次のパラメータを使用して、緑色蛍光神経信号(緑色蛍光)の点像分布関数(PSF)を計算します:
  1. 計算されたPSFを共焦点に設定します。中屈折率を 1.515 に、開口数を 1.25 に設定します。検出器のピンホールを1AUに設定します。レーザー励起波長を488nmに、発光波長を515nmに設定します。
2. 次のパラメータを使用して、赤色蛍光ミトコンドリアシグナル(赤色蛍光)のPSFを計算します:
  1. 計算されたPSFを共焦点に設定します。中屈折率を 1.515 に、開口数を 1.25 に設定します。検出器のピンホールを1AUに設定します。レーザー励起波長を543nmに、発光波長を617nmに設定します。
3. 上記の対応するPSFを使用したデコンボリューションと、100%の信頼性と10サイクルの反復制限で設定された反復修復機能によるデコンボリューションにより、神経とミトコンドリアの蛍光シグナルを最適化します。
神経特異的な表面の作成:
1. }「表面作成」ツールを使用して、タンパク質遺伝子産物9.5(PGP9.5)で同定された神経のデコンボリューションされた緑色蛍光二次標識から神経の固体表面を作成します。
2. 「smooth」機能のチェックを外し、絶対強度機能を使用して神経信号の閾値を設定します。これは、神経信号が背景の蛍光よりも大幅に明るいためです。
3. 絶対強度機能を使用して、神経信号はバックグラウンド蛍光よりも大幅に明るいため、神経信号のしきい値を設定します。神経を正確に識別するために、しきい値を十分に低く設定します。
4. サイズに基づいて、神経以外の小さな表面をフィルタリングします。
  注: 必要に応じて、「編集」タブ内の追加の非神経表面を手動で編集して、CONTROLキーを押しながら複数のオブジェクトを強調表示し、Deleteキーでそれらを削除します。
神経特異的な蛍光ミトコンドリアシグナルの単離:
1. 神経表面の「編集」タブを選択して、「マスクプロパティ」機能を表示します。作成された神経表面は、ケラチノサイトに関連するミトコンドリア信号から離れた神経内のミトコンドリアを分離するために使用されます。
2. 「Mask All」ボタンで「Mask Channel」ウィンドウが開くので、「Channel Selection」のプルダウンメニューからミトコンドリアシグナルのデコンボリューションされた赤色蛍光シグナルを選択します。
3. ボックス内をクリックして、「マスクを適用する前にチャネルを複製する」オプションにチェックマークを付けます。
4. [Mask Settings] の [Constant inside/outside] オプションの前にあるラジオボタンをクリックし、ボックス内をクリックして [Set voxel outside surface to] オプションにチェックを入れ、値に 0.00 を入力します。[OK]ボタンをクリックして、神経表面内のミトコンドリア信号を表す新しいチャネルを作成します。
ミトコンドリア特異的な表面を作成する:
1. }「表面を作成する」ツールを使用して、神経特異的なミトコンドリアシグナルの新しく作成された蛍光チャネルからミトコンドリアの固体表面を作成します。
2. 「スムーズ」機能のチェックを外し、「背景減算」機能を選択してしきい値を設定します。この機能は、ミトコンドリア信号の周囲の局所的なコントラストを使用して、背景からミトコンドリアを識別します。
3. ミトコンドリアを正確に識別するために、しきい値を十分に低く設定します。この例では、16 ビット (65,536) スケールの下限しきい値は 2,000 に設定されています。
4. サイズに基づいてミトコンドリア表面をフィルタリングします。この例では、ボクセル制限は 1.0 ボクセル (可能な限り低い制限) に設定されています。必要に応じて、「編集」タブでミトコンドリア以外の表面を手動で編集するには、CONTROLキーを押しながら複数のオブジェクトを選択し、Deleteキーでそれらを削除します。
  注: 時折、ソフトウェアは識別可能な蛍光ミトコンドリアシグナルに関連付けられていない表面を作成します。

名前	会社	カタログ番号	コメント
ライカ SP5 レーザー走査型共焦点顕微鏡	ライカマイクロシステムズ、イリノイ州バッファローグローブ	SP5
Volocity x64 ソフトウェア	Perkin Elmer, Waltham , MA	バージョン 4.4.0	Volocity ソフトウェアは画像処理に使用されます
Imaris x64 3D 解析ソフトウェア	Bitplane, Concord, MA	バージョン7.7.1	Imarisソフトウェアは画像解析に使用

表皮内神経線維内のミトコンドリアの可視化

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