神経ペプチドに対するショウジョウバエの脳応答を研究するための Ex vivo カルシウムイメージング

要約

出典: Ishimoto, H. et.al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオは、カルシウムイメージングの研究を示しています。ショウジョウバエ神経ペプチドに対する脳の反応。蛍光カルシウムインジケーターを発現するニューロンは、細胞内カルシウムの動態とシグナル伝達分子に対する機能応答を明らかにします。

プロトコル

1. 幼虫の脳外植片の準備

1. イメージングチャンバーを作ります。
   NOTE: 安定した記録には、脳外植片をつなぎとめる必要があります。ここでは、低コストの手作りのイメージングチャンバーがCa²⁺イメージングシステムで使用されていますで囲まれています。
   1. 鉗子を使用して、プラスチック製の培養皿(35 mm x 10 mm)の下部中央を引っ掻き、幼虫の脳の腹側神経節にへこみを作り、取り付けを容易にします（ステップ1.3、 Figure 1).
   2. つまようじで、へこみの両側に瞬間接着剤を少し垂らし、接着剤にタングステンロッド(直径0.125mm、長さ6〜7mm)を取り付けます。
   3. パテのような再利用可能な接着剤の小さな部分を使用して、へこみを囲む円形の壁(直径10 mm、高さ3 mm)を作成します（Figure 1)。
      NOTE: 壁の内側の空間は、後でリン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS; 0.14 M 塩化ナトリウム ( NaCl), 0.0027 M 塩化カリウム ( KCl), 0.01 M リン酸イオン (PO4^3–), pH 7.4 ± 25 °Cで0.05)。
2. 動物の準備
   NOTE: カルシウムイメージングでは、カルシウム指標であるGCaMP6sが目的の細胞タイプで表現され、これは一般的に組織特異的なGAL4とUAS-GCaMP6sの組み合わせを使用して達成されます。.シグナルが候補受容体を介して媒介されることを確実にするために、GCaMP6sは受容体の変異体欠損でも発現されます。
   1. 野生型や変異体など、異なる遺伝子型の実験的な比較が必要な場合、GCaMP6の発現レベルの変動や発達段階による生理学的な違いを避けるために、幼虫の年齢一致テストを実施します。
   2. 親のハエ(性別ごとに30匹)を標準的なハエの入った培養バイアルに8時間保管して、食品の表面に産卵できるようにします。25°Cおよび60-70%の相対湿度で12時間の明暗サイクルの下で大量の幼虫を培養します。

3. 幼虫の脳の解剖
   1. 産卵後90-120時間後に、幼虫を集めて蒸留水で少なくとも3回洗い、付着した食物の残骸を取り除きます。
   2. 氷のように冷たいPBSで満たされた正方形の1.5インチの時計ガラスに幼虫を置きます。
      NOTE: 次の2つのステップは、この時計ガラスの解剖顕微鏡下で行われます。
   3. 鉗子を使用して、幼虫の中央部分をそっとつかみます。別の鉗子を使用してマウスフックをつかみ、マウスフックをそっと引っ張って、脳を含む幼虫の前部を体の他の部分から分離します。
      NOTE: あるいは、手術用ハサミが使用できます。
   4. 鉗子で前部の先端を持ち、幼虫を裏返します。想像円板、脂肪体、リング腺など、脳に付着している無関係な組織を取り除きます。脳を口の部分からそっと分離します。
   5. イメージングチャンバー内のパテ状再利用可能な接着剤で作られたリングの内側に200μLのPBSを塗布します。PBSで解剖した脳をパスツールピペットに優しく吸引し、イメージングチャンバーに移します。

4. 脳をイメージングチャンバーにセット
   1. 鉗子を使って腹側神経節から伸びる筋線維をつかみます。タングステンワイヤーの下のへこみに脳をそっと挿入します。
   2. 別の鉗子を使用して、タングステンワイヤーを少し引き上げて、脳をイメージングの正しい位置に配置します（<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'図1).

2. Caの買収²⁺ 蛍光画像

注: PBSに浸された脳外植片は、20倍水浸対物レンズ(開口数、N.A. = 0.5)を装備した蛍光顕微鏡を使用して画像化されます。PBSは脳内の細胞を活性化しません。Z軸画像が必要な場合、対物レンズは圧電式レンズムーバーで取り付けられます。スピニングディスク共焦点ヘッドを使用して、時間分解能を向上させます。低照度イメージングでは、電子増倍電荷結合デバイスカメラを顕微鏡に搭載します。GCaMP6s蛍光のイメージング(励起/発光:488/509 nm)は、ダイクロイックビームスプリッターと発光フィルター(e.g..、528 ± 38 nmバンドパスフィルター)。

1. 脳外植片を含むイメージングチャンバーを顕微鏡下に置きます。
2. 対物レンズをPBSに触れるまで下げます。明視野照明の下で、脳の位置を固定し、焦点を合わせます。蛍光灯に切り替えて、GCaMP6sで標識された細胞にピントを合わせます。
   NOTE: 基本的な緑GCaMP6sの蛍光が見えるはずです。
3. 適切な取得ソフトウェアを使用して、水冷モードで512×512ピクセルの解像度で250ミリ秒/フレームで取得を開始します：<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>e.g., μManager)。露光時間を調整して、電荷結合素子(CCD)カメラのダイナミックレンジ内で、16ビット画像(ダイナミックレンジ0〜65,535)で1000(任意の単位)以上で蛍光値を取得します。
   NOTE: GCaMP6sの光退色を最小限に抑えるために、露光時間を短くする必要があります。曝露時間は、GCaMP6の発現レベルと検出システムの感度に依存するため、各実験で最適化する必要があります。私たちの実験では、dilp2>GCaMP6sを使用した>実験では100ミリ秒でした。 特定のイメージング深度に対してzセクションが必要な場合、露光時間とフレーム間隔に応じて複数のzセクション画像を取得することができます。カメラの空間解像度が十分にある場合は、ビニング サイズ (1 つのデジタル ピクセルにビン化されるチップ上のレジスタの数) を大きくして、露出時間を短縮する必要があります。
4. イメージングパラメータが決定されたら、ベースライン信号強度を検出するために、ペプチド投与の1分間の画像を撮影します（F₀)。
5. テストペプチドを適用します。このためには、100 μLのペプチド溶液をPBSに溶解し、幼虫浴に直接ピペットで移して最適な濃度にします。
   NOTE: ペプチド解決策はゆっくりと注入する必要があります（<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>例<span style='font-family：Arial,sans-serif;フォントサイズ:12pt;font-style:normal;font-variant:ノーマル;フォントの太さ:400;text-decoration:なし;vertical-align:ベースライン;white-space:pre-wrap;'>、流量20μL / s)をピペットを使用して浴溶液に入れます。PBSに溶解した無関係な合成ペプチドをネガティブコントロールとして使用します。
6. GCaMP6sの発光を数分間記録します。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
タングステンロッド	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	パテのような再利用可能な接着剤
時計ガラス, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., 草津市, 滋賀県日本	T900	リン酸塩添加緩衝塩
CCHa2	SCRUM Inc., 東京、日本		Custum合成ペプチド
グレリン	Peptide Institute Inc., 大阪, 日本	4372-s
ノシセプチン	ペプチド研究所 大阪、日本	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	蛍光顕微鏡
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, オーバーコッヘン、ドイツ	420957-9900-000	水浸対物レンズ
P-725 PIFOC対物レンズ、長距離走査型	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	圧電式レンズムーバー
共焦点スキャナーユニット CSU-W1	横河電機株式会社(本社:東京都)	CSU-W1	回転ディスク共焦点ヘッド
ImagEM C9100-13	浜松ホトニクス(静岡)日本	C9100-13	EM-CCDカメラ
OBIS 488 nm LS 60 mW	コヒーレント、 米国カリフォルニア州サンタクララ	1178770	488nm レーザー
488/568/647 nm 横河ダイクロイックビームスプリッター	米国ニューヨーク州ロチェスター、セムロック	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	ダイクロイックビームスプリッター
528/38 nm BrightLine シングルバンドバンドパスフィルター	セムロック、 米国ニューヨーク州ロチェスター	FF01-528/38-25	蛍光フィルター
μManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org