マウス脳切片における上衣細胞繊毛活性のライブイメージング

要約

出典:アルオムラン、A.J.、他.マウス脳の側脳室における上衣繊毛のライブイメージング. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、示差干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を使用して、マウスの矢状切片における上衣繊毛の鼓動を観察するライブイメージング技術を示しています。上体繊毛は脳脊髄液(CSF)を推進し、その活動は栄養豊富な培地で維持された脳切片に記録され、温度制御されたチャンバーで画像化されます。ハイコントラストビデオにより、機能性繊毛の同定と、その鼓動頻度の定量化が可能になります。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.脳の抽出、切片化、組織の準備

1. Sacrifice wild-type mouse strain C57BL/6 with CO₂ 5分間の窒息死を確定します。頸椎脱臼による死亡を確実にします。
2. マウスの頭部を70%エタノールで洗浄します。
3. 滅菌ハサミと鉗子を使用して、最初に皮膚を引き抜き、頭頂部から頭蓋骨を露出させることにより、頭蓋骨摘出術を実施します。
4. 次に、頭蓋骨が露出したら、骨を後側から前側に向かって一つずつ剥がして頭蓋骨を取り除きます。脳室を破壊しないように注意してください。
5. 脳全体を採取する。
6. 10%ウシ胎児血清(FBS)と10,000ユニット/ mlのペニシリンと10,000μg / mlのストレプトマイシンを含む1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を補給し、37°Cに予熱したダルベッコの修正イーグルス培地(DMEM)/高グルコースを含む100mmのシャーレに脳を置きます。
7. 鋭利な刃で正中矢状面上の脳を手でスライスし、ビブラトームを使用して各半分から最初の100〜200mmのセクションを取得します。
8. 予熱した37°Cリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)溶液で脳組織をすすぎます。
9. 脳切片を直ちに37°Cに予熱したDMEM/High-Glucose培地に入れます。

2. ライブイメージングの設定と設定

1. 1 mLのDMEM/High-Glucose培地を含む30 mmのガラス底培養皿に脳組織切片を置きます。顕微鏡の密閉されたチャンバー環境を37°C、95%/5%に調整₂/CO₂ content (図1).
2. 60倍対物レンズを使用して、60倍対物レンズに油滴を置き、規則的な微分干渉コントラスト(DIC)透過光で細胞に焦点を合わせることにより、上衣細胞/繊毛像を収集します。
3. 次に、DMEMバブルの動きの方向をたどり、運動性上衣繊毛の位置をガイドします。毛様体の鼓動がその領域に一種のバブルの動きを作り出すためです。DICフィルターを使用して、脳の側脳室に運動性繊毛を持つ健康な細胞を含む領域を選択します。上衣繊毛が見つかったら、光と焦点を調整して満足のいく画像を取得します。
4. Metamorphイメージングソフトウェアを使用して、特定の目的に応じてライブイメージングパラメータを設定します。このデモンストレーションでは、カメラのビニングを 1 x 1 に設定し、60X 対物レンズと 5-10 ミリ秒の露光時間を組み合わせて 24 ビットの画像を取得します。
5. 顕微鏡の開口部を最小露光時間に最適なレベルまで開いて、DIC画像を収集します。カメラにストリーミングされたライブ画像を観察し、遅延なく迅速かつ即時に画像を取得します。十分な画像コントラストを得るための最小露光時間の要件に基づいて、繊毛の鼓動速度を計算します。

結果

材料