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動物サンプルを含むすべての手順は、適切な者によってレビューされ、承認されています。動物倫理審査委員会。
1. 脳組織とSBFSEMイメージングの準備
- 若い(~2 - 4ヶ月齢)C57ブラックマウス(C57BL/6J株)に、施設のガイドラインに従って4 - 5%のイソフルランを使用して麻酔をかけます。筋緊張の喪失、随意運動の欠如、尻尾のつまみのような嫌悪刺激への反応を監視することにより、麻酔を確認します。
- マウスを解剖トレイに固定し、腹側正中線に沿って皮膚を切開します。マウスの胸郭を露出させるために、皮膚にさらに切開を行います。横隔膜を切開し、胸腔を周辺に沿って慎重に解剖して鼓動する心臓を露出させ、次に右心房を切開します。
- 蝶カニューレを使用して、左心室にカニューレを挿入します。肝臓の色の変化によって放血が確認されるまで、10〜20 mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH 7.2を使用してマウスを経心的に灌流します。.
Note: 肝臓の色の変化は、放血の程度を判断するためのガイドとして使用されます。肝臓の色が赤褐色から淡いピンク色に変わることを確認します。 - 0.10 Mカコジル酸緩衝液(pH 7.2)で作製した2%グルタルアルデヒドと4%パラホルムアルデヒドを10〜20 mL使用してマウスを経心灌流し、脳組織を内部から迅速に固定します。尾部の硬化を観察することで、固着をモニターします。
Note: カコジル酸ナトリウム2.14gを水80mlに溶解して0.10Mカコジル酸緩衝液(pH7.2)を調製し、塩酸を加えてpHを調整し、水で容量を100mlにします。 - 灌流後、マウスの首を切って脳を解剖し、続いて2%のグルタルアルデヒドと4%のパラホルムアルデヒドを含む0.10Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)に48時間4時間固定しますoC.
- 48時間後、ビブラトームを使用して400μmの冠状切片を作成し、次に解剖顕微鏡で脳の関心領域(海馬など)を慎重に解剖します。ティッシュを慎重にトリミングし、向きを保つために写真を撮ります。
Note: SBFSEMにおける組織染色の後処理法は、分解能を向上させるために、さまざまな重金属染色法を組み合わせています。 . - グルタルアルデヒド固定組織を0.1 Mカコジル酸緩衝液(pH 7.2)で3回、各5分間洗浄します。
- タンニン酸を0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)に溶解することにより、0.1%タンニン酸溶液を調製します。溶解するまで渦巻き、必要に応じて0.45μmフィルターでろ過します。
- 1 mLの試薬でRTで30〜60分間インキュベートすることにより、カコジル酸緩衝液0.1%タンニン酸で組織を後置します。
Note: インキュベーション時間は組織のサイズによって異なりますが、ほとんどの組織では30分が最適です。 - 組織をカコジル酸緩衝液(pH 7.2)で3回、各5分間洗浄します。
- 0.3 gのフェロシアン化カリウムと0.86 gのカコジル酸ナトリウムを10 mlの蒸留H< speed='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>2O (dH2O). フェロシアン化カリウム溶液を氷の上に置いてください。使用直前に、4%四酸化オスミウムを10ml追加してください（OsO4)を追加します。
- 組織を2%オスミウム-フェロシアン化物溶液で氷上で90分間染色します。dH2O.
- 0.1 g TCHを10 mL dHに溶解して1%チオカルボヒドラジド(TCH)溶液を準備します2O. 完全に溶解するまで10分ごとに渦巻くことにより、60°Cで溶解します。TCHを取り扱う際は、特に金属の使用、高温への加熱、溶液の乾燥を避けるように注意する必要があります。
- 新たに調製した1% TCHでRTで20分間サンプルを処理 dHで5分ずつ3回洗浄< style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>2O.
- 4%OsO4 dHで2%まで2O、そして組織を2%四酸化オスミウム水溶液で1時間インキュベートして染色します。ティッシュを3回、それぞれ5分、dH2O.
- サンプルO/NをdH style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>2O at 4 °C.
- ウォルトンの鉛アスパラギン酸溶液を準備します。
- L-アスパラギン酸0.998gを250mlのdHに溶解2O そして、pHが5.5に達するまで10Nの水酸化カリウム(KOH)を滴下します。pH調整後、アスパラギン酸ストック10 mLに硝酸鉛0.066 gを加え、60°Cで30分間加熱します。
- dHでティッシュをすすぎます2Oを添加し、ウォルトンのアスパラギン酸鉛染色剤と60°Cのオーブンで30分間インキュベートします。dH2O.
- 20%、50%、75%、85%、95%のエタノールをそれぞれ5分間冷却し、続いて100%エタノールを各10分間3回、100%エタノールを使用して、段階的な一連のアルコールでサンプルを脱水します。
Note: 開けたエタノールは空気中の水分を吸収し、埋め込みに失敗するため、開封したてのボトルから100%エタノールを使用してください。より大きな組織サンプルでは、より長いインキュベーションが必要になります。 - サンプルをプロピレンオキシドで2回、各15分間洗浄します。
- 樹脂25ml、DDSA(コハク酸無水ドデセニル)、NMA(無水メチルメチル)15.5ml、DMP-30(2,4,6-トリスジメチルアミノメチルフェノール)1mlを用いてプラスチック包埋樹脂を作製します。レジンを振って混ぜます。回転させ、気泡が解消するまで樹脂を放置します。
Note: これは標準的な中硬度のレシピです。他のタイプの電子顕微鏡(EM)プラスチック樹脂を使用することもできますが、すべての樹脂がSBFSEMで機能するわけではないため、事前に必須ではない制御サンプルでテストする必要があります。 - 最初にキャップをし、2時間後にキャップを解除して、プロピレンオキシドが約8〜10時間にわたって蒸発するように、バイアルに包埋樹脂とプロピレンオキシドの50:50混合物で組織O / Nをインキュベー
トします。- 組織を清潔なバイアルに100%新鮮な包埋樹脂に2時間移します。
- 新しい包埋樹脂にサンプルを埋め込み、印刷された紙ラベルが入った平らな型に埋め込み、60°Cのオーブンで48時間硬化させます。約1時間後、再度ティッシュの配置とアライメントを確認し、必要に応じて調整します。
- サンプルを関心のある領域にトリミングし、ゲル化シアノアクリレートスーパーグルーまたは導電性エポキシ樹脂を使用してアルミニウムピンに取り付けます。次に、ブロックの側面をコロイド状の銀ペーストでコーティングして、アルミニウムピンへの導電性経路を提供します。
- チャンバー内ウルトラミクロトームステージと低kV反射電子検出器を備えた走査型電子顕微鏡システムを用いて組織試料を検査します。
注：<span style='font-family:Arial,sans-serif;フォントサイズ:12pt;font-style:normal;font-variant:ノーマル;フォントの太さ:400;text-decoration:なし;vertical-align:ベースライン;white-space:pre-wrap;'>走査型電子顕微鏡(SEM)の使用に関する機器および現場でのトレーニングを受け、認定ユーザーになりましょう。あるいは、小規模なプロジェクトのために研究者や中核施設とのコラボレーションが可能になるかもしれません。SEMはX線を生成するため、放射線トレーニングも必要になる場合があります。 - サンプルをイメージングするには、次の設定を使用します:2.25 kV、5 - 10 nm/ピクセルの解像度、フィールドサイズはx、yで80〜250 μm(他のフィールドサイズも可能)、スライスの厚さは50〜100 nm、16〜20時間の期間で合計250〜600スライス。
Note:設定は、顕微鏡、個々のサンプル、および必要な分解能によって大きく異なります。これらの設定により、多くのサンプルで容易に解釈できる画像が生成される必要があります。
2. イメージングデータセットの分析
注: Image J/Fijiソフトウェアはデータセットの分析に使用され、TrakEM2プラグインに依存しています。前処理ステップは、さまざまなソフトウェアを使用して実行でき、経験レベルと取得したスタックに応じて、広範囲または軽微な場合があります。ここでは、オープンソースソフトウェア(ImageJ ver 1.50b、FIJIダウンロード2015年10月1日)を使用した主な変換について説明します。
- ソフトウェアを開き、メニュー項目Image→Type→8bitを選択することにより、元の独自の16ビット画像から画像を8ビットtiff形式に変換します。
- このステップ中の自動コントラスト/輝度変換が画像にとって理想的でない場合は、16ビット画像を再度開き、Image→Adjust→Brightness/Contrastを押してください。すべての画像に適した範囲を選択し、[適用]を押します。Note: 一部のSEMでは、このステップは顕微鏡を必要とする場合があります。メーカーソフトウェア。
- 必要に応じて、スライス間の画像移動が許容できないため (e.g..充電によるドリフト)、画像スタックを登録/整列します (メニュー項目 Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT)。ほとんどの登録ソフトウェアでは、「剛体」ではなく「翻訳専用」モードに設定します。
Note: 多くのアプローチとソフトウェアが機能する可能性があります:SIFT登録プラグインは多くのアプリケーションで機能し、仮想スタックバージョンがあります。- 必要に応じて、登録前にキャンバスサイズを拡大するか(Image→Adjust→CanvasSize)、関心のある領域まで縮小します(Image→Crop)。
Note: ドリフトやスパンが発生する場合があり、他のプラグインやソフトウェアを試すと、より良い結果が得られる場合があります。手動オプションも利用可能です（e.g<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>.ImageJ/FIJI、プラグイン→登録→ManualLandmarkSelection)。
- 必要に応じて、ImageJ (Image→Scale)を使用して、画像をより小さく、より管理しやすいサイズに拡大縮小します（e.g<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>. 25%) ImageJ（ImageScale を使用)。