蛍光トレーシングによるマウス網膜神経節細胞サブタイプの同定

要約

Source：<a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'>Laboissonniere, et. al.網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオは、トランスジェニックマウス網膜の網膜神経節細胞（RGC）サブタイプを特定するための蛍光追跡技術を示しています。このプロセスには、単離された網膜を記録チャンバーに固定し、酸素化灌流で細胞生存率を維持し、トレーサー付きのピペットを使用して蛍光標識RGCを標的化することが含まれます。樹状突起の形態と層別化を解析することにより、この方法は異なるRGCサブタイプの分類を可能にします。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査によって審査され、承認されています。

1. 網膜組織の準備 (2 時間)

注: このセクションのすべての手順は、薄暗い赤色の照明下で実行する必要があります

1. 解剖前に少なくとも1時間暗順適応動物。薄暗い赤い照明の下ですべての手順を実行します。
2. CO₂窒息により動物を安楽死させ、眼球を事前に酸素化された細胞外溶液でペトリ皿に除く。
3. 角膜を針で突き刺し、角膜と強膜の境界を眼ハサミで切って切り取ります。
4. #5鉗子を使用してレンズを取り外します。鉗子で強膜にそっと裂け目を作り、網膜と強膜が出会うところの視神経を切断します。網膜から強膜を慎重に取り除きます。
5. #5鉗子を使用して透明なガラス質を取り除きます。除去されると、硝子体は鉗子に付着したゼラチン状の物質のように見えます。網膜を半分にスライスし(動物あたり4個になるように)、RTで酸素化細胞外溶液に使用まで保存します。
6. 組織を記録チャンバーにマウントする準備ができたら、網膜を500 μLの酸素化細胞外溶液で希釈した酵素溶液でインキュベートします。ペトリ皿に加わって室温(RT)で2分間シェーカーでインキュベートします。
   1. 網膜片を酸素化された細胞外溶液で洗浄し、組織をガラス底の記録チャンバーに入れます。先端を切り落としたプラスチック製の移送ピペットを使用して、組織に損傷を与えることなく網膜を移植できるようにします。
7. 鉗子を使用して、視細胞層を下に向けて組織を慎重に平らにします。ピペットを使用して余分な水分を取り除きます。ナイロンメッシュのプラチナリングを使用して組織を固定します。
   注:この方法は、標識されたアマクリン細胞および双極細胞からのRNAの単離のための組織の準備にも使用できます。
8. チャンバーに酸素化された細胞外溶液を充填し、顕微鏡ステージにマウントします。2-4 mL/min.

3.GFP+網膜神経節細胞の可視化とターゲティング (10分)

注: このセクションのすべての手順は、薄暗い赤色の照明の下で実行する必要があります

1. 始める前に マイクロピペットプーラーを用いた電気生理学的記録用のプルガラス製マイクロピペット(外径[OD]:1.2mm、内径[ID]:0.69mm)。電極には次のプロトコルを使用します(パラメータを適宜調整して目的の抵抗を達成する必要があり、プーラー間やガラスによって異なることに注意してください): 熱:ランプ +10;プル:0;ベル:23;遅延:1;圧力:500;プログラムループ:5回。チップの直径が ~1 μm で、大きなセルを標的とする場合は 2 〜 4 MΩ の抵抗、小さな細胞を標的とする場合は 5 〜 7 MΩ の抵抗があることを確認します。
2. IR-DIC(Infrared Differential Interference Contrast)光学系(Figure 1A)を使用して神経節細胞層を観察します。落射蛍光法(~480 nm)を使用して緑色蛍光タンパク質(GFP)+ 網膜神経節細胞(RGC)を同定します(図1B)。
3. DIC内の細胞内溶液を充填したピペットの位置を確認します。アンプにわずかな正圧とゼロ電圧オフセットを適用します。
4. ガラス製マイクロピペットをGFP+細胞に押し付け、負圧を加えてピペットと細胞膜の間にGΩシールを形成します。テスト電圧コマンドステップ(、例えば 5 mV)を適用して、シール抵抗を監視します。安定したシールを形成した後、負圧の短いパルスを印加してメンブレンを破裂させ、全細胞アクセスを獲得します。
5. 細胞の樹状突起が蛍光トレーサーで満たされるまで1〜2分待ちます。
   注: 細胞は、落射蛍光で形態を調べることで形態学的に型付けできます (Figure 1C)。メラノプシンを発現するRGCの場合、蛍光トレーサーで満たされた樹状突起を落射蛍光照明下で調べ、それらが体細胞から遠く離れたOFFサブラミナ(M1 ipRGC)、ONサブラミナの神経節細胞層の近く(M2 & M4 ipRGC)、またはその両方(M3 ipRGC)を決定することにより、内側のフジツ状層の樹状突起層成層を可視化します。この観察結果と体細胞のサイズ(M4は他のすべてのipRGCサブタイプと比較して明らかに大きな体細胞を持つ)と組み合わせることで、細胞型の同定が可能になります。したがって、この技術により、RNA単離前に細胞型{{}}をin vitroで同定することができます。この方法は、樹状突起形態または細胞生理学のいずれかが関与する他の細胞型同定プロトコルに変更することができます。

結果

Figure 1: GFP Expression in Melan...

材料