有髄マウス軸索におけるニューロフィラメント輸送の蛍光光活性化イメージング

要約

出典:Boyer, N. P. et.al., 切除マウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと分析. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、分析するための蛍光光活性化法を示しています。末梢神経の有髄軸索におけるニューロフィラメント輸送。光活性化された緑色の蛍光色素でタグ付けされたニューロフィラメントを追跡することにより、この技術は神経変性疾患における軸索輸送に関する洞察を提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 神経生理食塩水の調製

1. }のブロイヤー生理食塩水100mLを作る:98 mM塩化ナトリウム(NaCl)、1 mM塩化カリウム(KCl)、2 mMリン酸二水素カリウム(KH₂PO₄)、 1 mM 硫酸マグネシウム (MgSO₄)、1.5 mM 塩化カルシウム (CaCl₂)、5.6% D-グルコース、23.8 mM 重炭酸ナトリウム (NaHCO₃) を二重蒸留水で。
2. 使用前に、少なくとも30分間生理食塩水を通して95%酸素/ 5%二酸化炭素(カルボゲン)を泡立てます。.残った生理食塩水は1週間以内に再利用できます。ただし、使用する前に毎回再酸素化する必要があります。
3. 酸素化生理食塩水を60mLシリンジに注ぎ、シリンジに残っている空気が最小限であることを確認します。

2. 神経灌流室

1. {{}}のようにシリンジとチューブを接続 図1Aのようにシリンジとチューブを接続し、流出管を廃液フラスコに入れます。
2. 外側のガスケットを灌流チャンバーハウジングに配置し、フローインレットとアウトレットポストがガスケットの穴と揃っていることを確認します。
3. インナーガスケット(シリコン、厚さ100μm)を#1.5円形カバースリップ(直径40 mm)に置き、ガスケットのしわを慎重に滑らかにして、しっかりと密閉します。後で組み立てるのを容易にするために、カバースリップとガスケットをペーパータオルの上に置くか、ガスケットを上に向けてタスクワイプします。

3.マウス脛骨神経の解剖と準備

1. 二酸化炭素吸入または他の施設が承認した方法で動物を犠牲にします。動物が動きや呼吸を止めたらタイマーを開始し、実験は犠牲から3時間以内にのみ行う必要があります。
2. 毛皮に70%エタノールをスプレーし、電気カミソリを使用して動物の足と背中からできるだけ多くのものを取り除きます。
3. 大きな解剖ハサミを使用して、背骨の中央近くの皮膚に背側切開を行い、動物の腹側側面の周りの切り込みを続けます。このカットから始めて、筋肉からそっと引き離して筋膜をカットすることにより、脚から皮膚をゆっくりと反射させます。
4. 動物を解剖トレイの仰臥位に置き、4本の足すべてを固定します。オプションで、テールをピンで固定して、動きをさらに減らします。
5. マイクロダイセクションハサミを使用して、尾と膝の中間にある大腿部の筋肉を切開して、坐骨神経を露出させます。筋肉を通して見える神経が切断されていないことを確認してください。
6. 切開部を背側と腹側に伸ばして筋肉を切除します。同様に、ふくらはぎの筋肉を取り除き、神経の損傷を避けるために切り傷を浅く短く保ちます。
7. 脛骨神経が坐骨神経(膝)からかかとに分岐する点から、脛骨神経が完全に露出するまで筋肉を取り除きます(図2A)。
   注: 脛骨神経の解剖を含むすべてのステップで、神経内の光活性化可能な緑色蛍光タンパク質(paGFP)の偶発的な活性化の可能性を最小限に抑えるために、周囲光への不必要な曝露を避けてください。
8. 脊椎近位端の脛骨神経を一対の鉗子でつかみ、マイクロダイセクションハサミを使用して神経を切断します。神経に緊張がかからないように注意しながら、神経を筋肉から持ち上げ、アタッチメントを切断します。
9. 脛骨神経の脊椎遠位端を切断し、室温の酸素化生理食塩水の小さなシャーレに移します。この手順の時点から、常に神経の近位端と遠位端を追跡するようにしてください。
   注: これを行う一つの方法は、神経の遠位端に角度のある切り込みを入れてテーパーが見えるようにすることです。
10. 神経の近位端から始めて、露出した軸索の端を非常に細い先端の鉗子で優しくつかみます。
11. 2対目の鉗子で神経鞘を近位につかみ、神経の遠位端に向かってゆっくりと引っ張ります。神経鞘は、最小限の抵抗で軸索に沿ってスライドします。このプロセス中に神経に過度の張力が加えられないようにしてください。

4. 最終的な神経灌流チャンバーアセンブリ

1. 神経の近位端をつかんで生理食塩水から取り出し、内側のガスケットの長方形の開口部内の灌流チャンバーのカバーガラスにゆっくりと置きます。
2. 溝のある面が神経に面し、流れの方向が神経に平行になるように、マイクロ水道橋を神経の上にスライドを置きます。カバースリップとマイクロ水道橋アセンブリを裏返し、マイクロ水道橋スライドを外側ガスケットに取り付けた状態で灌流チャンバーハウジング内に置きます。神経と周囲のインナーガスケットは、ガスケットによって分離されたカバーガラスと微小水道管スライドの間に挟まれ、カバーガラスが上を向くようになります(図1B)。
3. 灌流チャンバーを金属製のハウジングに入れ、ロックリングを回転させて固定します。プラスチックハウジングがすべての金属クリップの下に完全に入っていることを確認し、生理食塩水の漏れを防ぐためにしっかりと締めます。締めすぎると、マイクロ水道橋のスライドやカバーガラスにひびが入る可能性があります。カバースリップが下を向くようにチャンバーを裏返します。
4. 生理食塩水シリンジプランジャーをゆっくりと押し下げて、灌流チャンバーを満たします。インレットチューブとアウトレットチューブ、アウトレットフラスコ、シリンジは、セットアップやイメージング中は常にチャンバー自体より上に高く保ちます。これにより、チャンバー内の負圧による気泡の発生やピントの不安定化の原因となるサイフォンを回避できます。
5. 灌流アセンブリを倒立顕微鏡ステージに移し、生理食塩水シリンジをシリンジポンプに取り付けます。0.25mL/minの流量でモーターを適切な速度で始動します。
6. 対物レンズヒーターを接続して37°Cに設定し、対物レンズにオイルを塗布し、灌流チャンバーをステージマウントに挿入します。
7. チャンバーヒーターパッドにオイルを塗布し、灌流チャンバーに取り付けます。チャンバーヒーターを接続してオンにします。
   注: 温度が変化すると、溶液のガス放出により灌流チャンバー内に気泡が形成されることがあります。気泡が発生した場合は、気泡がチャンバーから排出されるまで、溶液の流量を5〜10倍に一時的に増やします。
8. 灌流チャンバーをステージアダプターにロックし、対物レンズオイルをチャンバーの下側にあるカバースリップに接触させます。
   注: ここで使用されているASIステージアダプター付きのBioptechsチャンバーは、倒立顕微鏡構成用に設計されています。

5. 蛍光活性化と画像取得

1. 明視野照明を使用して、カバースリップ表面に最も近い神経の底面にある軸索の層に焦点を合わせます(図2B)。有髄軸索(通常、成体マウスの直径1〜6μm)は、コントラスト増強なしで明視野透過光照明の下で見えるミエリン鞘の存在によって識別できます。シュミット・ランターマンの裂け目とランビエの節点も容易に明らかです。無髄軸索はより細く(通常は直径<1μm)、一般に束(レマック束)に存在し、一般に互いに分離するには近すぎるほど密接に関連しています。
2. 顕微鏡で利用可能な場合は、オートフォーカスシステムをアクティブにして、タイムラプスイメージングの過程でピントを維持します。
3. 明視野の参照画像を取得します。画像に対する神経(脊椎近位端および遠位端)の向きを記録します。
4. 488 nmレーザーとpaGFPに適した蛍光フィルター(525/50 nmなど)を使用して共焦点画像を取得し、漂白前の自家蛍光を記録します。光退色を最小限に抑えるためにレーザー出力を低く保ち、それに応じて露光時間を調整して微弱な信号を検出します。例として、代表的なデータは5%のレーザー出力と4秒の露光で取得されました。取得設定を記録して、今後のすべての実験で使用します。
   注: 光活性化後、理想的なイメージング設定では、信号対雑音比が 8 >、20 枚の画像で元の信号の 25% 未満の光退色が生成されます。軸索は、当初と同様に広視野落射蛍光顕微鏡でイメージングすることもできますが、共焦点性がないため、画質は劣ります。
5. レーザー出力を通常のイメージングパワーの約5倍に設定し、露光時間3〜4分で画像を取得します。必須ではありませんが、このステップでは、バックグラウンドシグナルを低減し、光活性化蛍光のS/N比を最大化するために、自家蛍光やその他の不要な蛍光源を漂白することをお勧めします。
6. ステップ5.4で使用した設定で画像を取得し、この漂白ステップ後の活性化前の自家蛍光を記録します。
7. 明視野画像上で、目的の活性化ウィンドウサイズに等しい長さで軸索に平行な線を引きます。このウィンドウの長さは、実験の目標とパラメータによって異なりますが、一般的な長さは、パルスエスケープパラダイムで5μm、パルス拡散パラダイムで40μmです。
8. この線をガイドとして使用して、軸索に垂直な視野を横切る長方形の関心領域(ROI)を描画します。この領域は、光活性化されるすべての軸索を包含する必要があります。
9. 405nm照明での光活性化の最適な設定を決定します。
   注: このステップとサブステップは、最初の実験的なアクティベーションの前にのみ実行してください。実験の過程では、同じ光活性化設定を使用する必要があります。
   1. 405 nmレーザーライン、低レーザー出力(例:5%)、ピクセル滞留時間(例:40 μs)、および1パルスを使用して関心領域を繰り返し活性化し、各活性化後に活性化された緑色蛍光タンパク質またはGFP蛍光の画像を取得します。蛍光が増加しなくなるまで繰り返し、その後、各画像の関心領域の蛍光を定量化します。
   2. 平均蛍光強度とパルス数をプロットします。蛍光が増加しなくなるまでのパルス数を、活性化に最適なパルス数として選択します。
10. ステップ5.8で描いた領域のpaGFP蛍光を、405 nm光によるパターン励起により活性化します。イメージがアクティブ化の直前と直後に取得されるようにします。
    注: 理想的なpaGFP活性化は、関心領域またはROI内に明確な境界を持つ明確に定義された蛍光領域を生成します。
11. アクティベーションが完了したら、1分間のタイマーを開始します。1分が経過すると、タイムラプスシリーズの撮影を開始します。
    注: paGFPの光活性化後に観察される蛍光の増加を可能にするために、1分間の遅延が必要です。パルス拡散法では、30秒のタイムラプス間隔で5〜10分の取得期間があれば、中央窓と隣接窓の初期勾配を測定して速度と方向性を測定するのに十分です。パルスエスケープ法では、5分または10分のタイムラプス間隔で30〜150分の取得期間を設けることで、フィラメントの長期的な一時停止挙動を解析することができます。
12. 取得したすべての画像と、蛍光活性化に使用したROIを保存します。
13. 神経の新しい領域に移動し、手順5.1〜5.11を繰り返します。新しい領域が同じ軸索に沿っている場合、他の活性化領域から移動した蛍光ニューロフィラメントの検出を避けるために、以前に活性化された領域から少なくとも500μm離れている必要があります。最終的なタイムラプスの取得は、3 時間のウィンドウが終了する前に完了する必要があります。
    NOTE: 準備が3時間以上持続する可能性がありますが、それは確認していません。熟練した解剖と準備により、この3時間以内に5〜8つの10分間のタイムラプス画像セットを取得できます。
14. 最終的なタイムラプス画像シリーズが取得されたら、生理食塩水の流れを止め、溶液とチャンバーヒーターを切断し、顕微鏡ステージから灌流装置を取り外してください。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
14 x 22 長方形ガスケット 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	Inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm 穴付き丸型ガスケット	Bioptechs	1907-08-750	Outer gasket
35 x 10mm 皿	Thermo Fisher	153066	Dissection dishes
40mm丸いカバースリップ	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - ルアーロックチップ	BD	309653
Andor Revolution WD 回転ディスク共焦点システム	Andor		パーフェクトフォーカスとFRAPPAシステムを装備
塩化カルシウム	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	フルオレセインスライド用
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
ピンの解剖	ファインサイエンスツール	26001-70
解剖鉗子	ファインサイエンスツール	11251-30	先端が細かい鉗子
解剖顕微鏡	Zeiss	47 50 03
ワックスでパンを解剖	ギンズバーグ・サイエンティフィック	568859
解剖ハサミ	ファインサイエンスツール	14061-09	初期解剖ハサミ
FCS2 灌流チャンバー	Bioptechs	60319-02-03
フルオレセインナトリウム	Fluka	46960
インラインソリューションヒーター	ワーナーインストゥルメンツ	SH27-B
椎弓切除鉗子	ファインサイエンスツール	11223-20	初期解剖鉗子
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506<
Microaqueductスライド	Bioptechs	130119-5<
顕微鏡スライド	Fisher	12-544-3	フルオレセインスライドの場合
顕微鏡ステージ挿入	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Objective ヒーターシステム	Okolab		Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A	ニコン	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
塩化カリウム	Fisher	P217
リン酸カリウム	Sigma-Aldrich	P0662
重炭酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S6297
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S7653
シリンジポンプ	Sage Instruments	Model 355
チューブアダプター - メス	Small Parts Inc.	1005109
チューブアダプター - オス	Small Parts Inc.	1005012
Tygon チューブ	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" 壁の厚さ
Vannas spring scissors	ファインサイエンスツール	15018-10	fine はさみ

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