マウスの子犬の神経形態をイメージングするための2光子顕微鏡法

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医によってレビューされています。<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>

1. 頭蓋窓の準備

1. イソフルラン(1.0% - 2.0%)を使用して子犬に麻酔をかけ、尻尾つまみテストで麻酔レベルを確認します。
2. 滅菌したカミソリの刃で頭蓋骨を慎重に開き、硬膜を無傷(直径1mm)のままにします（Figure 1C).皮質緩衝液(125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 10 mmol/L glucose, 10 mmol/L HEPES (4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid), 2 mmol/L CaCl₂<, and 2 mmol/L MgSO₄; pH 7.4; 300 mOsm/L; 室温)で出血を止めます。頭蓋骨を開くときは、脳表面を湿らせておくために皮質バッファーを塗布します。
3. ゼラチンスポンジを使用して、硬膜表面から緩衝液と血液を取り除きます。黄色のチップを使用して、1.0%低融点アガロース(皮質バッファーに溶解)の薄層を塗布します。ヒートブロックマシンを使用して、塗布するまでアガロース溶液の温度を42°Cに保ちます。
   注: 緩衝液と血液の排出は、乾燥したゼラチンスポンジが硬膜に接触しないように注意しながら、開頭術の側面から行う必要があります。そうしないと、硬膜が損傷する可能性があります。
4. 丸いガラスカバースリップ(No.1、直径3mm)をアガロースゲル層に塗布します。カバーガラスとアガロースゲル層の間に過剰なアガロースゲルを注ぐことにより、カバーガラスとアガロースゲル層の間のすべての気泡を取り除きます。ピンセットを使用して、カバーガラスの下から突き出た余分なゲルを取り除きます（<span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Figure 1D と1E).
5. 歯科用セメントを使用してカバースリップを固定します（Figure 1F)。
6. セメントパウダーとセメント液を混ぜます。固まる前に黄色の先端を使用して混合物を塗布します。硬膜に歯科用セメントを塗布しないでください、これは脳に損傷を与える可能性があります。
7. 滅菌チタンバーを取り付けます（カスタムメイド、約30 mg、参照：Figure 1G)歯科用セメントを使用して頭蓋骨に。チタンバーとカバースリップ(硬膜の表面)を平行に揃えると、画像を簡単にキャプチャできます。
8. 露出した頭蓋骨を歯科用セメントで覆います（Figure 1H)。
9. 子犬を麻酔から回復させます。歯科用セメントが固まるまで(1時間)、ヒーター(37°C)に置いておきます。

2. 二光子イメージング

1. 2光子レーザーの波長を設定します。RFP(赤色蛍光タンパク質)励起には、1,000 nm(400 μmの深さで450 mW/mm2)を使用します。
   NOTE: レーザーパワーZ 位置が上に移動するにつれて、Z 位置を小さくする必要があります。
2. カバーガラスの表面を70%エタノールで拭きます。
3. イソフルラン(1.5%〜2.0%)を使用して子犬に麻酔をかけ、テールピンチテストを使用して麻酔レベルを確認します。
4. 子犬の頭部にチタンバーを使用して、イメージングステージ上のチタンプレートに子犬を取り付けます（図2A and 2B).ゴニオメーターステージを使用して、カバースリップが対物レンズと平行になるようにヘッドを調整します（Figure 2B).温熱パッド(37°C)を使用して子犬の体温を維持します。
5. イソフルラン濃度を0.7%〜1.0%に設定します。
   NOTE:イソフルラン濃度が非常に高いと、イメージング中に子犬が事故死する可能性があります。
6. 2光子顕微鏡の対物レンズ(20X、NA 1.0)の下にイメージングステージを置きます（図2B and 2C).
7. カバーガラスに水を1滴垂らします。落射蛍光を使用して、硬膜が露出した領域で蛍光タンパク質標識ニューロンを見つけます。
8. zスタック画像を1.4μm間隔で取得します。レイヤー4ニューロンイメージングの場合、z幅を150〜300μmに設定して、樹状突起全体の形態をイメージングします）Figure 2Dと2E).低速スキャンと平均化を使用して、ニューロンの形態を示す鮮明な画像を取得します(樹状突起の形態全体を取得するには、通常>20分かかります)。
   注: イメージングには、以下のパラメータを推奨します。励起波長:1,000 nm、スキャナー:ガルバノメータータイプ、ダイクロイックミラー:690 nm、蛍光フィルター:575 - 620 nmバンドパス、検出器:GaAsPタイプ、ゲイン設定>100、画像サイズ>512×512μm、視野>600×600μm、画素分解能<1.2μm。

図1:手術、頭蓋窓の準備、チタンバーの取り付け。(A)このパネルは、頭蓋骨を覆っている皮膚の除去を示しています。(B)このパネルは、皮膚と頭蓋骨の間の隙間の固定を示しています。結像部にボンドを塗布しないように注意してください。(C)露出したデュラのイメージです。頭蓋骨と硬膜の間にカミソリの刃が挿入され、頭蓋骨が露出した領域(矢じり)の左側に羽ばたかれて開きました。その後、鉗子を使用して骨を簡単に取り除くことができます。(D)これは、頭蓋窓の垂直図を示す概略図です。カバーガラスと硬膜の間の隙間は、アガロースゲルの薄い層で埋められています。カバースリップは、歯科用セメントを使用して頭蓋骨に固定されます。(E)丸い形状のカバースリップをアガロースゲル層上に置きます。(F)固定されたカバースリップのイメージです。(G)チタンバーのデザインを展示したパネルです。チタンバーには、イメージングステージに取り付けるための2つのネジ穴(図2を参照)と、子犬の頭に取り付けられる平らな長方形の部分が1つあります。(H)チタンバーの長方形の部分は、歯科用セメントを使用して子犬の頭蓋骨に取り付けられています。

Figure 2: In vivo 新生児マウスの皮質ニューロンの2光子イメージング (A) このパネルは、チタンプレートのデザインを示しています。チタンプレートには、チタンバーを取り付けるためのネジ穴が2つと、イメージングステージ上に置かれるゴニオメーターステージを取り付けるためのネジ穴が4つあります。固定には直径2.5mm×長さ2mmのネジを使用します。(B)イメージングステージに装着された仔犬の代表画像です。子犬の体温はヒーターを使って維持されます。(C)子犬は、in vivoイメージング手順中にイソフルランを使用して麻酔されます。(D)このパネルは、P5 仔の層 4 皮質ニューロンの代表的な Z スタック タイムラプス画像を示しています。矢印は、樹状突起がぼやけているニューロンを示しており、これは分析から削除する必要があります。(E)このパネルは、パネルDに矢印が付いたニューロンの高倍率のタイムラプス画像を示しています。青い矢印:4.5時間で引っ込められる樹状突起の先端、黄色の矢印:4.5時間で伸びる樹状突起の先端、小さな白い矢印の先端:隣接する細胞の軸索。(F)これは、パネルEの左図にあるニューロンの樹状突起痕跡の3Dモデルです。青い円はセル本体の位置を示します。(G)このパネルは、解析に含まれていない切断された樹状突起を持つ代表的なニューロンを示しています。パネルD、-Gのサンプルデータには、NR1(NMDA型グルタミン酸受容体の必須サブユニット)でノックアウトされたニューロンが含まれています(著者から入手可能なデータが限られているため)。