ショウジョウバエの脳構造におけるカルシウム過渡現象の研究のための生物発光イメージング

要約

Source：<a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/53705/in-vivo-functional-brain-imaging-approach-based-on-bioluminescent'>ラーク、A. R.、 et. al., 生物発光カルシウム指標GFP-aequorinに基づく生体内機能脳イメージングアプローチ。 J. Vis. Exp. (2016)

このビデオは、緑色蛍光タンパク質-イクオリン生物発光を使用したカルシウムダイナミクスのリアルタイムイメージングを示しています。 ショウジョウバエの 脳の深部構造。

プロトコル

1. イメージング

1. セットアップ
   1. )顕微鏡、コンピューター、カメラ、排水システムの電源を入れ、部屋の環境制御を25°Cに設定して、記録システムを起動します。
   2. 測定を開き、コンピューター上の Automation Explorer プログラム。「デバイスとインタフェース」をクリックし、「NI Motion Devices」をダブルクリックし、最後に「PCI-7334」を右クリックして「デバイスの初期化」を選択します。
   3. Photon Imagerを開きます。新しいフォルダを作成し、最初の録音ファイルに名前を付けます。システムが機能する前に、カメラが-80°Cに達する必要があります。
   4. 灌流システムのセットアップ:KCl(塩化カリウム)、ニコチン、リンゲル液をリザーバーに加え、各溶液が2 ml / minで排出されるように調整します。実験を開始する前に、リンガー溶液で洗浄してください。
2. サンプルを調製します
   1. イメージングマウントブロックディッシュを顕微鏡下でマウントに置き、穿刺を通して灌流チューブをチャネルに挿入します。
   2. 顕微鏡を蛍光モードに設定し、キノコ体(MB)を中心に合わせます。20倍に調整し、中心を合わせ直してピントを合わせます。
   3. 排水装置を排水プールの上に置き、先端がプールのすぐ上に来るように排水シャントの高さを調整し、リンガー溶液を30秒間実行して、適切な排水を確保します。
   4. シールドを引き下げて、装置を光から遮断します。フォトンイメージャの自動化システムを使用して、ピントを微調整し、MBの参照蛍光画像を撮影します。
3. 記録
   1. フォトン速度を希望の記録速度(50ミリ秒から1秒以上)に調整します。フォトンモードを選択し、シャッターを開けます。遺伝子型、性別、年齢、サンプル数をログエントリに記録します。ROI(Region of interest)ボックスを萼と細胞体(CCB)および内側葉の上に配置するには、ROIボックスをクリックし、コントロールを押しながらドラッグします。
   2. ベースラインを約5〜10分間記録します(必要に応じて)。
   3. ニコチンを1分間塗布します。ログの開始/停止をメモします。リンゲル液で5分間洗浄します。
   4. 回復まで5分待ち、KCl(塩化カリウム)ログエントリとタイマーを準備します。
   5. KClを1分間塗布します。ログの開始/停止をメモします。Ringer's solutionで1分間洗浄します.
   6. 蛍光モードに切り替え、最終的な蛍光画像を撮影し、Ringer's solutionの電源を切ります。
   7. 「Stop」を押すと、システムをシャットダウンするかどうかを確認するダイアログボックスが表示されます。「いいえ」を選択して録音を続行します。
   8. シールドを開き、ドレナージシステムを動かし、レンズ対物レンズを5Xに切り替えて、灌流チューブを取り外します。サンプル/収録皿をステージから取り外し、20倍レンズを水で2回すすぎ、拭いて拭きます。
   9. プログラムウィンドウの上部にある白い再生ボタンを押して、次の録音を開始します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S3014
塩化カルシウム	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
Potassium chloride	Prolabo	26 764.298
塩化マグネシウム	Prolabo	25 108.295
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
ニコチン	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	アデノシン5′-三リン酸二ナトリウム塩水和物
Benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Cat #301コエレンテラジン h	http://www.prolume.com/
ピペットのヒント	Corning Incorporated	4868	100-1000μL Univesal Pipette Tip
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (-80°Cまで冷却)
Microscope	Nikon	N/A	Eclipse-E800
没入型対物レンズ	Nikon	N/A	20x Fluor .5w
蛍光顕微鏡の解剖	ライカMZ Fl III	N/A	Leica dissection scope and florescent lamp
蠕動ポンプ	Gilson	N/A	Minipuls 2
Tubing	Fisher Scientific	thickness によります	Tygon R3603, St-Gobain
Perfusion system	Warner	64-0135 (VC-66CS)	灌流バルブ制御システム、完全、ピンチバルブ付き、6チャンネル
Perfusion regulators	Leventon	201108	Dosi-flow 3
Measurement and automation explorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	software https://www.microsoft.com
Virtual dub	open access	N/A	software http://virtualdub.sourceforge.net/