ゼブラフィッシュララバにおける2光子顕微鏡を用いた標的ニューロンアブレーション

要約

出典:武藤、A.、他.ゼブラフィッシュ幼生におけるカルシウムイメージングと行動記録を用いた2光子レーザーを用いた神経集団のアブレーションとその評価 J. Vis. Exp. (2018)

}このビデオでは、 2光子レーザーアブレーション手順が実証され、アガロース固定化されたゼブラフィッシュの幼生における蛍光ニューロンの選択的破壊が可能になります。施術前後の高解像度イメージングにより、蛍光がないことで観察されるように、効率的なニューロンの損傷が確認されます。

プロトコル

1. 2光子レーザー顕微鏡を使用したニューロンの亜集団のアブレーション

1. まず、研究対象の特定のニューロンをラベル付けするGal4ラインとUAS:EGFPまたはUAShspzGCaMP6sの合致を設定します。必ずnacre背景を使用して、nacreホモ接合体を取得できるようにしてください。
   注：<span style='font-family:Roboto;font-size:12.0pt;' lang='EN-US'>nacre は、体表面にメラノフォアを含んでいません（図1B).本研究では、Gal4系統のgSAIzGFFM119B(pretectumを標識する)と別のGal4系統のhspGFFDMC76A(ILH(視床下部葉を標識する)を使用する。

2. 交配設定の翌日に、ゼブラフィッシュの卵を集めて幼虫の段階まで育てます。その時点で、目的のニューロンが蛍光レポーターを発現します。

3. ゼブラフィッシュの幼生を2%の低融点アガロースにマウントします（図1B）。

1. まず、2%アガロースストック溶液を準備します：2gの低融点アガロース粉末を100mLのシステム水(すなわち、循環水系で成魚のゼブラフィッシュを維持するために使用される水)またはE3水、電子レンジで水を沸点まで持ってきて、激しく混合します。

   1. 2%の低融点アガロースストックを沸騰するまで電子レンジで加熱します。3.5〜4.0mLのアガロースを6cmのシャーレの蓋に注ぎます。アガロースが冷えるまで待って、触ると温かくなってから先に進みます。

   2. 次に、アガロースに1匹の幼虫(この段階で麻酔をかけていない)を入れます。アガロースが固化して幼虫の適切な位置を確保するまで、解剖針(図1C)を使用して、幼虫の位置と向きを直立するように調整し続けます。
      注:アガロースが固まる間、幼虫は泳ぎ続けます。

   3. 幼虫が配置されたら、アガロースが完全に固まるまで5分間待ちます。

   4. アガロースに5mLのトリカイン溶液(1倍の作業濃度で0.4%)を注ぎます。
      注: レーザーアブレーション中の幼虫の動きを避けるために、アブレーション手順の間、幼虫は麻酔をかけ続けなければなりません。

4. 2光子レーザー顕微鏡システムの漂白機能を使用して幼虫をアブレーションします。

1. アガロースに埋め込まれた幼虫を2光子レーザー走査型顕微鏡の下に置き、顕微鏡システムを起動します。

2. 画像取得ソフトウェアを起動し、「レーザー」タブの「オン」ボタンをクリックしてレーザーをオンにします(図1D).レーザーの「ステータス」が「ビジー」から「モードロック」に変わるのを待ちます。

3. 「チャンネル」タブで、EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)アブレーションの場合はレーザーの波長を880 nm(最大出力:約2,300 mW)に設定し、GCaMPアブレーションの場合は800 nm(最大出力:約2,600 mW)に設定します。

4. レンズリボルバーを手動で動かして20倍対物レンズを選択します。「Locate」タブをクリックし、「GFP」(Green Fluorescent Protein)をクリックして光路を変更し、蛍光を目で直接観察します。

5. ゼブラフィッシュの幼生の脳を視界の中心に位置づけ、「Acquisition」タブをクリックして二光子顕微鏡に戻ります。

6. 「アブレーション前」の状態の記録として、20倍の対物レンズで高速スキャンでzスタック画像を撮影してください（熱による損傷を避けるため)。後で、アブレーション実験の前後に撮影した画像を比較します(図2A)。zスタックを取得するには、[Zスタック]をクリックしてzスタックオプションを選択し、タブを展開します。幼虫の脳の腹側端に焦点を絞った後に下限を設定し(「Set First」ボタンをクリック)、脳の背側最表面に焦点を絞った後に上限を設定します(「Set Last」ボタンをクリック)。次に、「実験を開始」ボタンをクリックして、z-stack画像取得を実行します。

7. レンズリボルバーを手動で動かして63倍対物レンズを選択します。

8. 「検索」タブをクリックして落射蛍光顕微鏡に切り替え、目でアブレーションする細胞を視界の中心で見つけてから、「取得」タブをクリックしてレーザー走査型顕微鏡に戻ります。

5. 「Acquisition Mode」タブで、「Frame Size」を256 x 256に設定してください。「Live」をクリックして、目的のニューロンを観察します。

6. 最も背側から始めて、アブレーションするセルが焦点を合わせている焦点面を見つけます。

7. 「Regions」関数を使用して、各ニューロンの直径の約3分の1の細胞サイズの小さな円形領域を関心領域(ROI)としてマークします。

8. スキャン速度を13.93 s/256 x 256ピクセル(134.42 μm x 134.42 μm)に設定します。これは、レーザー滞留時間が約200 μs/ピクセル、または200 μs/0.5 μmに相当します。また、4回の繰り返しを設定します(「反復サイクル:4」)。または、十分なアブレーションが達成されるように、反復回数とスキャン速度を最適化します。

9. アブレーションの「漂白」機能を実行し、サンプル(アブレーション前後)を画像化するための「時系列（2サイクル)」や、使用するソフトウェア(図1D)の「領域」または同等の機能）を画像

化します。

10. 時系列サイクルの最初の画像(アブレーション前)と2番目の画像(アブレーション後)を比較することにより、漂白後に対象細胞の蛍光がバックグラウンドレベルで観察されたものまで減少することを確認してください（図2B)。

11. アブレーション後も蛍光が残っている場合は、反復回数を増やしてください。

12. 次に、焦点面を少し深く動かします（i.e., 腹側に向かって)、アブレーションされていない細胞が現れる次の焦点面を選択してください。

13. 漂白機能を実行してください。目的の神経構造内のすべての細胞がアブレーションされるまで、これらの手順を繰り返します。

14. アブレーションする神経構造を覆うすべての焦点面を通過した後、細胞が消失した蛍光を確認します。アブレーションが不十分なために一部の細胞がまだ蛍光性であることがわかった場合は、上記のように再度レーザー照射してください。

15. レーザー照射後に幼虫をアガロースから回収する必要がある場合は、幼虫を傷つける可能性があるため、アガロースから無理に引き出そうとしないでください。代わりに、幼虫の周りのアガロースに体の表面に対して垂直に小さな切り込みを慎重に作ります。次に、麻酔薬が切れたときに幼虫が自然にアガロースから泳ぎ出すのを待ちます。

16. 次の幼虫に進むか、調査中の行動に関与していない別のニューロン集団を使用して制御実験を行います。
    注：ここでは、UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B幼虫の嗅球ニューロンを、上記と同じプロトコルを使用してレーザーアブレーションしました（図2A、右)）。

17. Caイメージングまたは行動記録に進む前に、回復に数時間または1日かかります。この回復期間中、幼虫の健康状態(つまり、通常の自泳、アブレーション領域の周囲に明らかな熱損傷がない、etc.)を確認し、兆候を示す幼虫を取り除きます。健康状態が悪い。

結果

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NuSieve GTG アガロース	ロンザ	Cat.#50080	低融点アガロース
6 cm シャーレ	ファルコン	製品#:351007
解剖針	AS ONE CORPORATION	Cat.No. 2-013-01	https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP	カール・ツァイス		二光子レーザー走査型顕微鏡
W プランアポクロマート63x/1.0	カール・ツァイス		63X対物レンズ
Imager.Z1	カール・ツァイス		脱射蛍光顕微鏡
ZEN	カール・ツァイス		共焦点顕微鏡用画像取得ソフトウェア
セキュアシールハイブリダイゼーションチャンバーガスケット, 8チャンバー、直径9 mm x 深さ0.8 mm	分子プローブ	カタログ# S-24732	Caイメージングの記録チャンバーとして使用
イメージングチャンバー	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5	行動記録チャンバーとして使用
サージカルナイフ	MANI	眼科用ナイフ MST15
ORCA-Flash4.0	浜松ホトニクス	model:C11440-22CU	科学用CMOSカメラ
HCImage	浜松ホトニクス		画像ソフトウェア
ハードディスク記録モジュール	浜松ホトニクス		動画ファイルをハードディスクドライブに短時間保存できるソフトウェアモジュール
SZX7	オリンパス		ステレオスコープ
DF PL 0.5X	Olympus		用対物レンズ SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio	FLIR Systems, Inc.	製品番号GS3-U3-41C6NIR-C	CMOSカメラ
XIMEA xiQカメラ	XIMEA	製品番号MQ042RG-CM	CMOSカメラ
リングLEDライト	CCS	型式: LDR2-100SW2-LA	白色LED
ナイロンメッシュ 32μm	東京スクリーン	N-No.380T	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
ナイロンメッシュ 13μm	東京スクリーン	N-No.508T-K	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
メタルセイブ 150ミクロン絞り	東京スクリーン		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
メタルセイブ 75ミクロン絞り	東京スクリーン		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	エビオサヒ食品ヘルスケア株式会社		乾燥ビール酵母
LabVIEW	National Instruments		An integrated development environment for programming
マイタイHP	Spectra Physics		二光子レーザー