マウス脳微小血管系のIn vivoイメージングのための2光子顕微鏡

要約

Source: Nishimura, C. ら。 HIV誘発性神経炎症のマウスモデルにおける2光子顕微鏡を用いた脳血管構造の定量化。 J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、2光子顕微鏡を用いたマウス脳の皮質毛細血管の生体内可視化を示しています。薄い頭蓋骨皮質窓を持つ麻酔マウスに蛍光色素を注入する手順、イメージングのためのセットアップを準備する手順、および分析のための脳微小血管構造の詳細な画像を取得する手順を概説します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1。蛍光色素の注入

1. #5鉗子を使用して左大腿内側の麻酔マウスの皮膚をつまみます。皮膚をそっと上に引っ張り、ハサミで皮膚を切って取り除きます。デキストラン標識赤色発光ローダミン色素(70 kDa)(生理食塩水に溶解した10 mg / kg)を調製します。.
2. 大腿静脈の位置を特定します。30 Gの針を取り付けた1 mLのシリンジを使用して、イメージングに適した蛍光色素のあらかじめ調製した溶液をシリンジの130 μlラインに引き込みます。染料をシリンジに完全に引き込み、シリンジの壁をしっかりとフリックして、すべての気泡を取り除きます。
   1. 30 Gの針を硬い面の斜角面を上にして、約30度の角度で曲げます。針に色素を充填し、余分な液体を捨てて、100 μlのサンプルを残します。
3. 100 μlの色素サンプルをゆっくりと大腿静脈に注入します。針を抜いた後、出血を止めるために、注射部位にしっかりと穏やかな圧力をかけます。染料を5分間循環させます。
4. 4-0縫合糸で皮膚を縫い合わせて左大腿部を閉じ、マウスを慎重に胃の上にひっくり返し、マウスのヘッドプレートハーネスに入れます。
   

2. In Vivo 2光子イメージング

1. 手術装置を2光子顕微鏡に移行し、 継続的な麻酔レベルを維持するようにしてください。少量の0.9%生理食塩水をヘッドプレートリザーバーに入れ、顕微鏡の対物レンズを下げて生理食塩水に接触させます。明視野表示対物レンズを使用して、対象領域を特定します。
2. 2光子レーザー励起を蛍光色素に適した波長に設定します。25倍対物レンズを使用して2光子イメージングを開始します。
   これらの実験では、波長780nmで励起された赤色発光ローダミン色素に結合したデキストランを使用したことに注意してください。607/36バンドパス蛍光フィルターを使用して色素からの蛍光を検出し、480/20バンドパス蛍光フィルターを使用して動脈自家蛍光を検出しました。
3. ビュースクリーン上で毛細血管ベッドを見つけ、光学ズーム2を使用してこの領域を拡大します。2光子イメージングソフトウェアを使用して毛細血管の画像を取得します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
T/PUMP	ゲイマー・インダストリーズ社	TP-500
TEC-4 イソフルラン気化器	Datex Ohmeda	447
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
デュモット #5 鉗子	ファインサイエンスツール	11295-10
テキサスレッドデキストラン (70,000 MW, 10 mg/kg 生理食塩水溶解)	Invitrogen	D-1830
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM 多光子顕微鏡	オリプマス	FV-1000 MPE
マイタイHP DeepSee Ti:Saレーザー	スペクトル物理学
アミラソフトウェア	Visage Imaging