$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. FLIMデータの取得
注:このプロトコルでは、蛍光色素の寿命は時間領域TCSPC法によって取得されます。FLIMでは、レーザーによって設定された一定の繰り返し速度で光のパルスを生成する必要があります。繰り返し率はレーザーの種類によって異なり、ユーザーが知っておく必要があります。寿命測定は、従来の顕微鏡と一緒に設置された検出器と電子機器によって達成されます。このプロトコルでは、mRFP、CFP、YFPの寿命をそれぞれ取得するために、2つの異なる会社が提供する検出器とソフトウェア(Table of Materials)を備えた3つの異なるレーザー走査型共焦点顕微鏡で測定が行われます。開始する前に、適切な発光/励起フィルターが配置されていることを確認し、バックグラウンドまたはモニターのバックライトを最小限に抑えてください。実験を開始する前に、選択した蛍光色素の光安定性を確立してください。蛍光色素が線虫組織内で短時間で漂白する場合、C.エレガンスでのFLIM測定には適していません。
- FLIM取得ソフトウェアを開きます。FLIMソフトウェアでは、共焦点顕微鏡の制御も可能です。検出器の出力を有効にするためのタブ/ボタンを見つけて、出力を有効にするを押します。
- 計測器のセットアップのタイミング確度を表す計測器応答関数(IRF)を取得します。
注: この手順は、できれば線虫を取り付ける前に実行する必要があります。- 可能な場合は、励起/発光フィルターを取り外します。
- 対物レンズの上に空のカバースリップを置き、その表面を見つけます。カバースリップから取得した散乱信号を最低30秒間記録します
注: 数ナノ秒の寿命の場合、取得ソフトウェアはIRFシフトを自動的に推定できます。IRFを取得することは常にお勧めします。
- C. elegans がマウントされたスライドをステージに置きます。透過モードで10倍倍レンズを使用し、スライド上の線虫の位置を特定します。
- スライドを取り外し、対物レンズを63倍倍に切り替えて、必要な液浸媒体(オイルなど)を塗布します。ステージ上のスライドを置き換え、線虫の位置を特定します。
- 取得ソフトウェアでPinhole Managerを開き、Maximumを開きます。サンプルのスキャンを開始し、関心領域(頭、上半身など)を選択し、その最大投影面に焦点を合わせます。
- ソフトウェアのインターフェースに表示されるレーザーパルスレートと他の3つの値を監視します:Constant Fraction Discriminator (CFD)、Time-to-Amplitude (TAC)、アナログ-デジタルコンバーター (ADC)。
注: TAG_146 TAG_145 TAG_144レーザーの最大ゲートは 1 x 108 単一光子カウントである必要があります。この数値は、レーザーによって供給される光子の最大数を表します。CFDは、検出器によるレーザーパルスを基準とした単一光子パルスの受信に関する情報を提供します。この値は、おおよそ 1 x 105 です。TACは、1つの光子が検出された時間と次のレーザーパルスを区別します。最後に、ADCはTAC電圧を保存可能なメモリ信号に変換します。CFD、TAC、およびADCは、蛍光色素分子から放出される光子が失われないように、すべて同様の値を持つ必要があります。これらのパラメータを正しく評価することで、正確なライフタイムマップを作成するのに十分な光子が収集されていることが保証されます。 - FLIMソフトウェアのインターフェースで、検出された光子の数をプレビューします:ADCの値は、1 x 104から1 x 105の間である必要があります。必要に応じて、焦点を別の平面に移すか、レーザー出力を上げてより多くの光子を収集します。
注: 一般に、1秒間に記録される光子の数は、レーザーの繰り返し率の1%を超えてはなりません。 - メニューバーで、取得パラメータを設定するタブを選択します。スキャン同期inを選択して、単一光子検出を可能にします。
- 取得を固定時間または固定のフォトン数に設定します。たとえば、2 分間、または 1 つのピクセルが 2,000 の単一イベントのフォトン カウントに達するまで、ライフタイム減衰曲線を取得します。Startを押して取得を開始します。
注: 蛍光色素が異なれば、必要な励起レーザーと発光レーザー、フィルターも異なります。サンプルの明るさに応じて、レーザー出力も調整でき、寿命を妨げません。これらのプロトコルでは、YFP ex500/em520-50 nm、mRFP ex561/em580-620 nm の励起/発光設定を使用します。ex800/em440 nmを用いたCFP測定には、パルス2光子レーザーを用いた。FLIMマップの取得に必要な時間と光子数は、各セットアップと各実験目的について経験的に確立する必要があります。
2. FLIMfitソフトウェア
注:インペリアルカレッジロンドンで開発されたFLIMfitソフトウェアツールを使用してデータ分析を実行します（図1を参照)。
- ソフトウェアを開き、File |FLIMデータを読み込みます。1つの条件からすべてのサンプルをロードします(異なるセッションや異なる生物学的リピートから取得されたサンプルも同様です)。
- 必要に応じて、Segmentation |セグメンテーションマネージャー.クロップツールを対象領域の周囲でドラッグして、ハイライト表示します。完了したら、OK を押します。
NOTE: セグメンテーションはすべての画像に対して行う必要があります。 - C. elegans の強度ベースの画像が表示される小さな領域を選択します (Figure 1、矢印 1)。その領域の減衰曲線は、インターフェースの右側にある大きな減衰ウィンドウに表示されます (図 1、矢印 2)。
注: 減衰は線形または対数で表示できます。 - 手順2.5-2.8で説明されているように、ソフトウェアのアルゴリズムを使用して寿命を推定するための正しいパラメータを設定します。
- Data タブ (図 1、矢印 3):
- ] 任意の 積分最小値 値を設定して、暗すぎて生成できないピクセルを除外します。フィット感が良い。TAG_355}}C. elegans サンプルによって、この値は 40 から 300 まで変化します。満足のいくプレビューが得られるまで、さまざまな値を入力します。
- Time Min と Time Max の数値を選択して、FLIM 信号をこれらの値に制限します。このしきい値の前後に出現するすべてのイベントは除外されます。
NOTE: たとえば、mRFP の解析では、800 ps より前と 4,000 ps より後のイベントは除外されました。これらの値は蛍光色素の寿命によって異なり、エンドユーザーが決定する必要があります。 - プリセットのCounts/Photonのプリセットは変更しないでください。
- 取得時に使用するレーザーのRepetition RateをMHz単位で入力します。
注: 現在のプロトコルでは、さまざまなレーザーがさまざまな繰り返し率で利用されていました。CFPの寿命の取得に使用される2光子レーザーは80MHzの繰り返し周波数を持ち、YFPの場合、レーザーは40MHzで繰り返され、mRFPの場合、値は78.01MHzです。これらの値は、分析されたサンプルに従ってFLIMfitに入力されました。 - Gate Max の値を入力して、すべての飽和ピクセルを除外します。
注: C. elegans での寿命測定の場合、この値は任意の大きな数値 (例: 1 x 108 で測定されます)。
- Lifetimeタブで、使用するグローバルフィットを選択します(例:ピクセル単位のフィッティング)。図 1、矢印 4 を参照してください。
注: A ピクセル単位のフィッティングTAG_484}} フィッティングは、個々のピクセルにフィットした減衰を生成します。イメージ単位のTAG_492 TAG_491 TAG_490フィッティングは、個々のイメージのグローバルフィットを生成し、イメージごとに1つのライフタイム値を表示します。グローバルワイズのフィッティングは、データセット全体にわたって単一のフィッティングを生成します。すべての画像に対して 1 つのライフタイム値が提供されます。 - No 以外のパラメータは変更しないでください。Exp 選択 選択した蛍光減衰が多指数関数的であり、1 回以上の寿命を示すことがわかっている場合。
NOTE: 現在のプロトコルでは、この関数を使用して、二指数関数的CFP蛍光色素分子の寿命を計算しました。 - IRFメニューからIRFをアップロードします:IRF |IRF を読み込みます。IRF シフトを推定するには、IRF |IRF シフト を推定します。一連の値は、IRF タブに自動的に表示されます。
- すべてのパラメータを設定したら、データセットの適合 (図1、 矢印5)。このアルゴリズムは、減衰曲線の適合を生成し、各画像のライフタイム値を確立します。
NOTE: 青い線で強調表示された結果のフィットは、すべてのイベントと重なる必要があります。すべてのイベントがフィットに沿って整列している場合、良好なフィットが得られます。 - ソフトウェアのインターフェースの右上のメニューにあるパラメータタブ）図1、矢印6)をクリックし、統計）w_mean（加重平均)）TAG_595}}chi2 値は 1 にできるだけ近づけます。
注: A chi2 に 1 つ近いと、適合の精度が保証されます。したがって、選択した画像のライフタイム値はtau_1として表示されます。 - 興味のある情報をエクスポートしてください: File |強度画像/フィット結果テーブル/画像/ヒストグラム.ライフタイムの計算に使用したデータ設定を保存します: File |データ保存設定.
注:使用されたパラメータは、選択したサンプルの将来の分析のために保存されます。
3. FLIMデータのグラフ表現
注: さまざまなサンプルから収集された寿命は、さまざまな方法で視覚的に表現できます。ライフタイム値をナノ秒またはピコ秒で表す場合に選択します。
- フィットの品質とカーブの精度を表示するには、FLIMfitから直接ディケイカーブをエクスポートします。
- フォトンの分布を表すには、フォトン カウントの周波数とヒストグラムのライフタイム値をプロットします。
- 最後に、統計的な比較のために、2つ以上のサンプルを比較する場合は、寿命値と平均の標準偏差を散布図の棒グラフに配置します。必要な統計分析を実行します。
