マイクロCTイメージングによるマウス脳血栓の可視化

要約

出典: Kim, D., et. al.脳血栓塞栓を直接視覚化するための近赤外蛍光イメージングとマイクロコンピューター断層撮影の組み合わせ。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、マイクロCT(Micro-CT)イメージングを用いてマウスの脳血栓を可視化する様子をご覧いただけます。脳血栓マウスモデルに、対照剤として作用するフィブリン標的金ナノ粒子を注入します。マウスをマイクロCT装置のベッドに置き、多角的な角度から画像を取得します。適切なソフトウェアを使用して、画像を再構築および処理します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 蛍光マーカーで標識した外因性形成血餅の調製(図1)

1. 3%酸素(1.5 L/分100%酸素)を混合した3%イソフルランを用いて、誘導チャンバー内でマウスに麻酔をかけます。筋肉の緊張を観察し、つま先のつま先つまみ反射がないことを確認することにより、適切な麻酔の深さを確保します。
2. 動物を腹臥位の滅菌ドレープに置き、吸入マスクと2%イソフルランと30%酸素を混合した麻酔下に置きます。無菌技術と滅菌ガウン/マスク/手袋/器具を使用して、次の手順を実行します。処置の前後に実験領域を70%アルコールで洗浄および消毒することにより、無菌状態を維持します。
3. 心臓穿刺後に約300~1,000μlの動脈血を採取します。全血70 μLを、活性化第XIII因子(FXIIIa)凝固酵素のフィブリン架橋活性に敏感なCy5.5蛍光プローブであるC15プローブ30 μL(20 μmol/L濃度)と混合し、血栓を蛍光標識します(図1A)。3mlの注射器(23ゲージ針)を使用して、長さ20cmのポリエチレンチューブ(PE-50、内径0.58mm)に混合血液を注入します。PEチューブは滅菌済み(または製造業者によって滅菌済みと認定されている)必要があり、血栓は組織培養フードで無菌的に調製する必要があります。
4. 呼吸と心臓の脈拍の欠如を観察して、動物の死を....

結果

Figure 1: 蛍光標識血栓の準備の概要。(A)血栓成熟の過程で活性化凝固因子XIIIaのフィブリン架橋酵素作用により血栓のフィブリン鎖に共有結合しているCy5.5近赤外蛍光(NIRF)プローブ(C15)と新鮮な全血を混合します。混合血液をポリエチレン(PE)-50チューブに注入し、血栓の形成と成熟を可能にするために24時間放置します。(B)C15プローブによる血栓の光学標識を確認するためのNIRFイメージング。PEチューブから除去された血栓を洗浄した後の持続的な蛍光に注意し.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マシン
microCT	NanoFocusRay, 全州, 韓国	NFR Polaris-G90
レーザードップラー流量計	Perimed, スウェーデン、ストックホルム	PeriFlux System 5000
手術顕微鏡	ライカマイクロシステムズ、ソウル、韓国	EZ4HD
吸入麻酔器	PerkinElmer, 米国マサチューセッツ州	XGI-8
ソフトウェア
NFR制御	NanoFocusRay, JeonJu, 韓国	NFR Polaris-G90	microCT制御ソフトウェア
Lucion	Infinitt, Seoul, Korea	Lucion	3Dレンダリングイメージングソフトウェア
ラボチャート7	ADInstruments, 米国コロラド州	ラボチャート7	rCBF
Image Jソフトウェア	Wanye Rasband, NIH, USA	1.49d	イメージング解析
デバイス/機器
輸液ポンプ	米国マサチューセッツ州ハーバード大学	ポンプ22(55-2226)
ホメオロマムブランケット	スペイン、バルセロナ、パンラブ	HB101
ポケット焼灼	大宗 ソウル、韓国	DJE-39
脳マトリックス	テッドペラ、カリフォルニア州、アメリカ	15003	コロナ切片
PE-50チューブ	夏目 東京、日本	SP-45(PE-50)	I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm
PE-10 チューブ	夏目、東京、日本	SP-10(PE-10)	I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm
30ゲージ針	Sungshim-medical, 韓国、ソウル
注射器	CPL-medical、安山、韓国		1 & 3 cc
ガーゼ	パナメディック、天安、 韓国
テープ	スコッチ、ソウル、韓国	3M-810
マイクロ鉗子	Fine Science Tools、バンクーバー、カナダ	11253-27	デュモン #L5
マイクロシザー	ファインサイエンスツールズ、バンクーバー、カナダ	15000-03	バナススプリング
シザー	ファインサイエンスツールズ、バンクーバー、カナダ	14084-08	8.5 cm
ブラックシルク縫合糸	アイリー、 釜山、韓国	SK6071、SK728	6-0 および 7-0
試薬
メロキシカム	Yuhan, ソウル、韓国
獣医軟膏	ノバルティス、バーゼル、スイス
10% ポビドンヨード(ベタジン)	フィルソン、天安、 韓国
塩化第二鉄	アメリカ合衆国 ミズーリ州 シグマ	157740-5G
TTC	アムレスコ (米国) オハイオ州	0765-100g
イソフルラン	ハナファム、京畿道、韓国	イフラン	100 mL
PBS	Welgene, Daegu, Korea	LB001-02	50 mL
金ナノ粒子			合成
生理食塩水	ダイハンファム、ソウル、韓国	48N3AF3	20 mL