マイクロCTイメージングによるマウス脳血栓の可視化

要約

出典: Kim, D., et. al.脳血栓塞栓を直接視覚化するための近赤外蛍光イメージングとマイクロコンピューター断層撮影の組み合わせ。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、マイクロCT(Micro-CT)イメージングを用いてマウスの脳血栓を可視化する様子をご覧いただけます。脳血栓マウスモデルに、対照剤として作用するフィブリン標的金ナノ粒子を注入します。マウスをマイクロCT装置のベッドに置き、多角的な角度から画像を取得します。適切なソフトウェアを使用して、画像を再構築および処理します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 蛍光マーカーで標識した外因性形成血餅の調製(図1)

1. 3%酸素(1.5 L/分100%酸素)を混合した3%イソフルランを用いて、誘導チャンバー内でマウスに麻酔をかけます。筋肉の緊張を観察し、つま先のつま先つまみ反射がないことを確認することにより、適切な麻酔の深さを確保します。
2. 動物を腹臥位の滅菌ドレープに置き、吸入マスクと2%イソフルランと30%酸素を混合した麻酔下に置きます。無菌技術と滅菌ガウン/マスク/手袋/器具を使用して、次の手順を実行します。処置の前後に実験領域を70%アルコールで洗浄および消毒することにより、無菌状態を維持します。
3. 心臓穿刺後に約300~1,000μlの動脈血を採取します。全血70 μLを、活性化第XIII因子(FXIIIa)凝固酵素のフィブリン架橋活性に敏感なCy5.5蛍光プローブであるC15プローブ30 μL(20 μmol/L濃度)と混合し、血栓を蛍光標識します(図1A)。3mlの注射器(23ゲージ針)を使用して、長さ20cmのポリエチレンチューブ(PE-50、内径0.58mm)に混合血液を注入します。PEチューブは滅菌済み(または製造業者によって滅菌済みと認定されている)必要があり、血栓は組織培養フードで無菌的に調製する必要があります。
4. 呼吸と心臓の脈拍の欠如を観察して、動物の死を確認します。
5. 血液を充填したチューブを室温で2時間放置し、次に4°Cで22時間放置し、以前に報告したように次の手順を実行します。.
6. 血栓を含むチューブを1.5cmの長さに切ります。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を充填した3 mLシリンジを使用して、PBSを各チューブに穏やかに注入することにより、血栓をPBS含有6ウェルプレートに排出します。血栓をPBSで3回洗浄します(図1B)。
7. 長さ15cmのPE-10チューブ(内径0.28mm)の遠位端部に、気泡を避けながら洗浄した血栓を慎重に引き抜き、洗浄した血栓を慎重に引き抜き、チューブの近位端に30ゲージの針を挿入した生理食塩水入り1ml注射器を使用します。
8. 血栓を充填したPE-10チューブを、先細りの端(I.D.200μm)を持つように修正された長さ3cmのPE-50チューブ(I.D.0.58mm)と接続し、塞栓性脳卒中のマウスモデル(図1C)の中大脳動脈(MCA)-内頸動脈(ICA)の前大脳動脈(ACA)分岐領域に配置されます)。

2. 血栓塞栓性脳卒中のマウスモデルのモデリング (図 2)

1. 別のマウスを麻酔し、30% 酸素 (1.5 L/min) を混合した 3% イソフルランを使用して、誘導チャンバーでストロークします。メロキシカム(5 mg / kg)を皮下に注射して、術後の痛みを和らげます。.筋肉の緊張を観察し、つま先のつま先つまみ反射がないことを確認することにより、適切な麻酔の深さを確保します。
2. 麻酔中の乾燥を防ぐために、各眼に少量の獣医用軟膏を塗布します。無菌技術と滅菌ガウン/マスク/手袋/器具を使用して、次の外科的処置を実行します。手術前、手術中、手術後に手術部位を70%アルコールで洗浄および消毒することにより、無菌状態を維持します。
3. マウスを手術台に移動します。動物を腹臥位の滅菌ドレープに置き、吸入マスクと2%イソフルランを使用して麻酔下に保ちます。次に、直腸体温計からのフィードバックを備えた恒温ブランケットを使用して、体温を36.5°Cにクランプします。
4. ベタジンと70%アルコールで外科的準備を行った後、左耳と目の間の頭皮にメスを使用して1cmの垂直切開を行います。レーザードップラー流量計の光ファイバーの遠位端を露出した左側の側頭骨表面(ブレグマの左1 mmと4 mm下)に接着します。次に、ドップラー フローの監視を開始します (図 2A
5. 動物を寝かせます。上の前歯をピンに取り付けた紐で引っ張るようにして首筋をまっすぐにし、首周りを剃ります。次に、3 cmの垂直正中線切開を行い、それを広げて開き、血管周囲の軟組織を解剖することにより、左頸動脈球領域を露出させます。迷走神経を傷つけないように注意してください。
6. 滅菌済みの 6-0 黒絹縫合糸を使用して左近位総頸動脈 (CCA) を結紮し、滅菌済みの 7-0 黒絹縫合糸を使用して左 ICA と左翼口蓋動脈 (PPA) を結紮します。
7. 左外頸動脈の枝である左上甲状腺動脈を単極電気焼灼を使用して焼灼し、左近位外頸動脈(ECA)を緩く、より遠位の部位を滅菌7-0ブラックシルク縫合糸を使用してしっかりと結紮します。
8. マイクロハサミを使用して、ECAの結紮部位間に小さな穴(直径約0.2~0.25μm)を開けます。
9. 血栓を含むカテーテルをECAの穴に挿入し、近位ECA結紮を緩めます。カテーテルをCCAに進めた後、近位ECA結紮を再度締めて、カテーテルを所定の位置に締めます。
10. 遠位結紮部位の遠位にあるECA遠位部分を切断するために焼灼し、カテーテルをCCAから引き抜くときに、遊離近位ECAを時計回りに回転させてICAの方向に位置合わせします。次に、ICA結紮を緩めた直後に、カテーテルを遠位ICAのMCA-ACA分岐領域に約9mm進めます。次に、ICAライゲーションを締めます。
11. シリンジ1mlをそっと押して血栓を注入することにより、血栓を分岐部に配置します。.血栓が血管を正常に閉塞した場合は、ベースラインと比較して 30% 以下に低下させるべきドップラー脳血流 (CBF) の減少を確認します (図 2B )。
12. カテーテルを取り外し、ECA近位部位をすぐにしっかりと結紮します。さらに、CCAとPPAをアンライゲーションします。
13. 6-0シルク縫合糸を使用して切開部位を閉じます。必要な時間(ここでは、血栓注射後30分間)ドップラーモニタリングを続けた後、麻酔を停止します。マウスを空のケージに戻し、加熱ランプで暖かく保ちます。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を得るまで、マウスを放置しないでください。

3. In Vivo MicroCTによる脳血栓のイメージング(図3)

1. ステップ2.1で説明したように、脳動脈に血栓が配置されているため、塞栓性脳卒中の発症後、あらかじめ指定された時点(ここでは1時間)にマウスに2%イソフルランを再麻酔します。つま先のつま先つまみ反射がないことを確認することにより、適切な麻酔の深さを確保します。麻酔中の乾燥を防ぐために、各眼に少量の獣医用軟膏を塗布します。
2. フィブリン標的金ナノ粒子(fib-GC-AuNP4)を10 mg Au/mlの濃度で10 mM PBSに再懸濁し、血栓造影剤を30分間超音波処理して、ナノ粒子の溶解と分散を確保します。300 μl fib-GC-AuNP (10 mg/ml) を陰茎静脈に注入します。
3. 動物をマイクロCT装置のベッドに置き、ピンに取り付けられたひもで上の前歯を引っ張って首をまっすぐにすると、モーションアーチファクトが軽減されます。
4. fib-GC-AuNPの注射後5分で、脳のマイクロCT画像の取得を開始します。ここで説明する実験では、次のイメージングパラメータを使用します:65 kVp、60 μA、26.7 x 26.7 x 27.9 mm³ 視野、0.053 x 0.053 x 0.054 mm³ ボクセルサイズ、100 ミリ秒/フレーム、1 平均化、360 ビュー、512 x 512 再構成マトリックス、600 スライス、 スキャン時間は 64 秒。
5. マウスを空のケージに戻し、加熱ランプで暖かく保ちます。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を得るまで、マウスを放置しないでください。
6. マイクロCTスキャナーにインストールされたソフトウェアパッケージ内の「Reconstruction」パネルの「Start」コマンドを使用して、生の画像データをDICOM(Digital Imaging and Communications in Medicine)形式に変換します。
7. 画像の定量解析(ステップ6)は、市販のソフトウェアパッケージを使用して、メーカーの指示に従ってDICOMデータをTIFF形式に変換してください。
8. 定性分析だけでなく、定量分析もより簡単かつ迅速に行うには、ソフトウェアパッケージとDICOM形式の元の0.054 mm厚の画像を使用して、次のように1mmまたは2mm(ここでは2mm)の厚さにレンダリングされた軸方向およびコロナル画像の新しいセットを生成します。
   1. 「Data Source」ツリーでDICOMフォルダを選択し、マウスの右ボタンをクリックして、フォルダを「MasterDB」または「PrivateDB」にインポートします。
   2. 「データソース」ツリーの「MasterDB」または「PrivateDB」をクリックし、インポートしたフォルダを選択します。左端のパネルの「3D」タブをクリックした後、「読み込みオプション」ウィンドウが表示されたら、「OK」を押して、フォルダ内の一連の画像をスタックとしてインポートします。
   3. 画像表現を最大強度投影(MIP)形式に変更するには、軸方向画像ウィンドウとコロナ画像ウィンドウで「MRP」という単語をクリックし、ポップアップメニューで「MIP」を選択します。その後、同じウィンドウで「TH : 0 [mm]」をクリックした後、画像の太さを2mmに変更します。
   4. 画像スタックを探索し、適切な角度と場所でスライスできる2mm幅の3Dナビゲーターバーを使用して、血栓を溜めるウィリス円(COW)を完全にカバーする厚さ2mmの軸断面画像を準備します。「Output」パネルのキャプチャボタン(カメラアイコン)をクリックします。画像をTIFF形式で保存します。
9. 次に、前頭葉から小脳まで連続して覆う厚さ2mmの冠状切片画像を5枚用意します。
   1. まず、ナビゲーターバーを軸方向画像に慎重に位置合わせして2番目のスライスを準備し、冠状画像がMCA-ACA血栓を最もよく視覚化できるようにします。

次に、他の4つのスライスを連続して準備します。「Output」パネルのキャプチャボタン(カメラアイコン)をクリックします。画像をTIFF形式で保存します。

結果

Figure 1: 蛍光標識血栓の準備の概要。(A)血栓成熟の過程で活性化凝固因子XIIIaのフィブリン架橋酵素作用により血栓のフィブリン鎖に共有結合しているCy5.5近赤外蛍光(NIRF)プローブ(C15)と新鮮な全血を混合します。混合血液をポリエチレン(PE)-50チューブに注入し、血栓の形成と成熟を可能にするために24時間放置します。(B)C15プローブによる血栓の光学標識を確認するためのNIRFイメージング。PEチューブから除去された血栓を洗浄した後の持続的な蛍光に注意し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マシン
microCT	NanoFocusRay, 全州, 韓国	NFR Polaris-G90
レーザードップラー流量計	Perimed, スウェーデン、ストックホルム	PeriFlux System 5000
手術顕微鏡	ライカマイクロシステムズ、ソウル、韓国	EZ4HD
吸入麻酔器	PerkinElmer, 米国マサチューセッツ州	XGI-8
ソフトウェア
NFR制御	NanoFocusRay, JeonJu, 韓国	NFR Polaris-G90	microCT制御ソフトウェア
Lucion	Infinitt, Seoul, Korea	Lucion	3Dレンダリングイメージングソフトウェア
ラボチャート7	ADInstruments, 米国コロラド州	ラボチャート7	rCBF
Image Jソフトウェア	Wanye Rasband, NIH, USA	1.49d	イメージング解析
デバイス/機器
輸液ポンプ	米国マサチューセッツ州ハーバード大学	ポンプ22(55-2226)
ホメオロマムブランケット	スペイン、バルセロナ、パンラブ	HB101
ポケット焼灼	大宗 ソウル、韓国	DJE-39
脳マトリックス	テッドペラ、カリフォルニア州、アメリカ	15003	コロナ切片
PE-50チューブ	夏目 東京、日本	SP-45(PE-50)	I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm
PE-10 チューブ	夏目、東京、日本	SP-10(PE-10)	I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm
30ゲージ針	Sungshim-medical, 韓国、ソウル
注射器	CPL-medical、安山、韓国		1 & 3 cc
ガーゼ	パナメディック、天安、 韓国
テープ	スコッチ、ソウル、韓国	3M-810
マイクロ鉗子	Fine Science Tools、バンクーバー、カナダ	11253-27	デュモン #L5
マイクロシザー	ファインサイエンスツールズ、バンクーバー、カナダ	15000-03	バナススプリング
シザー	ファインサイエンスツールズ、バンクーバー、カナダ	14084-08	8.5 cm
ブラックシルク縫合糸	アイリー、 釜山、韓国	SK6071、SK728	6-0 および 7-0
試薬
メロキシカム	Yuhan, ソウル、韓国
獣医軟膏	ノバルティス、バーゼル、スイス
10% ポビドンヨード(ベタジン)	フィルソン、天安、 韓国
塩化第二鉄	アメリカ合衆国 ミズーリ州 シグマ	157740-5G
TTC	アムレスコ (米国) オハイオ州	0765-100g
イソフルラン	ハナファム、京畿道、韓国	イフラン	100 mL
PBS	Welgene, Daegu, Korea	LB001-02	50 mL
金ナノ粒子			合成
生理食塩水	ダイハンファム、ソウル、韓国	48N3AF3	20 mL