ラット脳血行動態の非侵襲的高周波超音波およびドップラーイメージング

要約

出典: Giustetto, P., et al., Non-invasive Pranchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging.J. Vis. Exp. (2015年)

このビデオでは、高周波超音波と光音響イメージングを使用して、ラットの脳内の血管系とヘモグロビン含有量を研究する方法を示します。この手法は、脳灌流と血液酸素化に関する詳細な洞察を提供し、脳の血管構造と酸素分布の非侵襲的分析を可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.準備

1. 麻酔
   1. 動物を適切なイソフルランチャンバー内に入れて麻酔します。
   2. 2Lのガスチャンバーに2.5%の濃度でO₂と獣医用イソフルランガスを混合してチャンバーに充填し、ラットが眠りにつくまで約3分間待つ。つま先をつまんで麻酔の効果を確認します。
   3. 麻酔が有効になったら、ラットを取り外して体重を量ります。
   4. 水溶性眼科用ジェルの薄い層を動物の目に広げて、動物を保護し、眼の生理的水分補給を維持します。
   5. ラットを超音波および光音響イメージングステーションのワークトップに寝かせます。麻酔効果を維持するために、鼻を適切なマスクの内側にすばやく配置して、一定の麻酔の流れを提供します(イソフルラン2%-2.5%酸素1 L /分)。
2. 動物の髭剃り
   1. 脱毛クリームを頭の表面に一定に塗り、耳と首の周りのカバー部分に注意を払います。クリームが数分間作用するのを待ってから、へらでそっと取り出します。濡れたスポンジでクリームの残りをすべてそっと取り除き、肌を正確にきれいにします。
      注: 動物の毛皮は、超音波ベースの画像取得に悪影響を与える空気を閉じ込めるため、必然的に可能な限り除去する必要があります。
3. 動物の配置
   1. 動物を広げた位置に配置します。ワークトップ上の適切なバイタルパラメータセンサー(存在する場合)を使用してバイタルサインを監視します。プロの使用のために電極クリームを数滴塗布した後、センサーに足を傾けます。
      注: 麻酔中は、バイタルパラメータが次の値であることを確認してください:ラットの体温≈37.5°C、1分あたりの心拍数(BPM)は250〜350の間で変化し、呼吸数は毎分40〜80回の呼吸の範囲で構成されています。
   2. 最後に、低刺激性の人工シルクパッチで手足を固定します。必要に応じて、動物の目を保護するために、水溶性眼科用ゲルの薄い層を再度広げます。

2. 時間的視点からの画像取得

1. 動物の位置決め
   1. 動物を腹臥位に保ち、矢状体軸に対して約45°の傾斜角度で体をわずかに横に回転させます。小さなコットンガーゼロールをスタンドとして使用して、廃棄を正しく手配します(図1a)。
   2. 動物の頭を持ち上げ、片側を少し回転させます(図1a)。綿ロールをスタンドとして使用し、鼻先を麻酔マスクにしっかりと挿入します。
   3. ワークトップを水平面に対して約30°の角度で傾けます。
   4. イメージングトランスデューサを垂直面に対して約30°の角度で回転させます。
2. 超音波および光音響解剖学的および血管画像取得
   1. イメージングスキャンをオンにし、Bモード画像取得を開始し、実験の可能な要件を尊重するようにすべての画像取得パラメータを適切に設定します(図2a)。
      注: 送信中心周波数をできるだけ低く設定してください (16 MHz、図 2b)、トランスデューサの浸透深さを可能な限り大きくします。
   2. 動物の頭部に低刺激性の水溶性超音波透過ゲルの一貫した層(厚さ約1cm)を貼り付けます(図1b)。トランスデューサーヘッドを同じゲルの薄層で覆い、ラットの層に接触させます。局所的な低体温症を最小限に抑えるために、温かいジェルを使用してください。
   3. Bモードで画像取得を開始し、解剖学的基準を特定し、関心領域をモニターの中央点に中央に配置することにより、トランスデューサーの位置をリアルタイムで調整します。ゲル層に閉じ込められた任意のレベルで気泡を除去するようにしてください、なぜならそれらは獲得に悪影響を与えるからです。
   4. 探触子を耳と目をつなぐ仮想軸に位置合わせするように配置します(図3a)最適なビームフォーカライゼーションを取得します。時計回りまたは反時計回りの回転によって、脳内の体積のさまざまなビューを取得します(図3bとc)。
   5. 最終的には、トランスデューサーを機械式スタンドに固定して、位置を安定して固定し、向きを細かく調整します。
   6. 最適な光音響応答信号を受信するために、US-LASER探触子ソースに対して10 mmの深さに関心領域が位置していることを確認してください(図4)。次に、US波のフォーカライゼーションのインジケーターを分析領域の正確な中央に配置します。
      注: 関心のある領域の研究中は、位置決め手順を加速するために、呼吸ゲートオプションの起動を避けてください。
   7. カラードップラーモードに入ると、脳内の血管を高感度で視覚化できます。
   8. 必要な領域を視覚化するための適切な方法でポジショニングを設定したら、呼吸ゲートオプションをアクティブにして、動きに関連する望ましくない影響を回避します(図5a)。
   9. カラードップラーモード(図5b)で必要な取得パラメータを選択し、このモダリティで画像を取得して、浸透深さが数ミリメートルになるまで血流の速度と方向を区別します。

結果

図1:時間画像取得のための動物の処分。(a)画像取得のためのワークトップ上の動物の配置:頭を剃った後、動物を腹臥位にして、体を片側にわずかに傾けて頭の側頭を露出させます。ワークトップには、取得中に動物の体を暖かく保つためのヒーター装置が装備されている場合があります。一部の綿ロールを使用してこの位置を取得できますが、粘着パッチはバイタルサインモニタリングのためにセンサーに足を固定します。(b)超音波ゲルの一貫した層は、イメージング中にトランスデューサが配置される頭部の領域を覆います

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
高周波超音波・光音響イメージングステーション(VEVO LAZR 2100システム)	富士フイルムビジュアルソニックス株式会社
Vevoコンパクト二重麻酔システム(卓上版)	富士フイルムビジュアルソニックス株式会社		http://www.visualsonics.com/anesthesiasystem#sthash.opODtSht.dpuf
超音波透過ゲル (アクアソニック100)	パーカー研究所	01-08	http://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp
スプレイグ・ドーリーラット	チャールズリバー研究所		3匹の6週齢のスプレイグ・ドーリーラットは、チャールズリバー研究所によって購入され、標準的な住居(12時間)で飼われました。ライトダークサイクル)と標準的なげっ歯類のチャウと水を自由に利用できます。提供元: http://www.criver.com/