マウス網膜錐体光受容体におけるカルシウム動態モニタリングのための2光子顕微鏡法

要約

出典:Kulkarni, M. et al. Imaging Ca²⁺ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina.J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、トランスジェニックマウス網膜の錐体光受容体におけるカルシウム動態をモニターするための2光子顕微鏡の使用を示しています。網膜スライスの調製、FRETベースのカルシウムバイオセンサーのイメージング、および背景照明と光刺激下でのカルシウムレベルを定量化するための蛍光変化の分析の手順を概説します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. スライスの準備 (10 - 15 分)
   1. 事前に、網膜スライス用のニトロセルロースフィルター膜と、スライスを取り付けて記録室に移すためのガラスカバースリップを準備してください。ニトロセルロースフィルターメンブレンをハサミで約10 x 5 mmサイズの長方形にカットします。カバースリップをガラスカッターで約10×5mmの角形にカットします。
   2. スライドガラスを組織近くの細胞外溶液にゆっくりと浸します。HR2.1:TN-XL Ca²⁺ バイオセンサーマウスから得られた網膜切片を、神経節細胞の面を上にしてスライドガラス上にそっと引っ張り、一対の鉗子を使用して端をつかみます。このプロセスにより、組織の機械的損傷と折り畳みが減少します。
   3. それぞれの研究課題に関連する網膜の領域を選択します。湾曲したメスの刃を使用して、選択した網膜領域から長方形の約1 x 2 mmのピースを切り取ります。ティッシュの周りの余分な溶液を拭き取ります。
   4. 網膜の上にフィルター膜を置き、神経節細胞側が膜に付着するようにします。すぐに、細胞外培地をメンブレンに一滴加えて、組織をメンブレンにしっかりと付着させます。
   5. 膜に取り付けられた網膜組織を、新鮮な細胞外溶液を含むスライスチャンバーに移します。
   6. ティッシュチョッパーに取り付けられた新しいカミソリの刃を使用して、網膜を厚さ200μmの垂直スライスに切断します(図1B)。
      注:かみそりの刃は、切断時に「カチッ」という音で示されるように、膜全体が同時に裂けるように、スライスチャンバーの底面と完全に位置合わせする必要があります。そうしないと、ブレードが曲がってスライスが損傷する可能性があります。
   7. メンブレンの端のみに高真空グリースを塗布することにより、メンブレンに取り付けられた単一のスライスをガラスカバースリップに接着します(図1C)。網膜の下のガラス面にグリースが付着しないようにしてください。
   8. カバースリップに取り付けたスライスは、保持チャンバー(密閉された遮光容器、例えば、蓋がアルミアルミホイルで覆われたシャーレ)で細胞外溶液の滴で覆われています。室温(RT)の炭水化物雰囲気下に置いてください。小さな貯水池を泡立てて炭水化物を導入し、保持チャンバー内の大気を加湿状態に保ちます。これにより、スライスが乾燥するのを防ぎます。
   9. スライスを保持チャンバーで10〜15分間休ませてから、(1つずつ)記録チャンバーに移動します。スライスは、RT(~21°C)の保持チャンバーで最大4〜5時間維持できます。

2. 二光子Ca²⁺イメージング

1. 二光子顕微鏡
   1. 移動対物顕微鏡(MOM)型二光子顕微鏡を使用してください。
      注：以下の最小要件を満たす直立二光子顕微鏡は、以下の最小要件を満たす任意の直立二光子顕微鏡を使用することができます：(a)~860nmに調整可能なパルスレーザー、(b)同時に取得された蛍光チャンネルを最低2つ装備する必要があります（c)強化シアン蛍光タンパク質(eCFP)およびシトリン蛍光用のフィルター、(d)光刺激装置、および(e)目的のCa²⁺シグナルを解像するのに十分なフレームレートでタイムラプス画像シーケンスを記録できるソフトウェア。
   2. 製造元の指示に従って、2光子イメージングシステムを起動します。施設のレーザー安全ガイドラインに厳密に従ってください。レーザーを開始し、~860 nm に調整します。
   3. 保持チャンバーから記録チャンバーにスライスを移し、すぐにカルブキン化細胞外溶液で灌流を開始します。記録チャンバー内の灌流流量を2 mL/分、温度を37°Cに保ちます。
   4. 20X0.95開口数(NA)水浸対物レンズを使用します。可能な場合は、電荷結合素子(CCD)カメラと記録チャンバーの下にある赤外線発光ダイオード(LED)と組み合わせて使用し、網膜スライスを特定します(図2)。それ以外の場合は、2 光子イメージング (2.1.5 を参照) を使用してスライスを見つけます。
   5. 2光子イメージングに切り替えて、バイオセンサーの発現を確認します。eCFPとシトリンの蛍光イメージング用に2つの検出チャンネルをオンにします。
   6. 2光子顕微鏡を制御する画像取得ソフトウェアを使用して、記録用のコーン端子の列をスキャンして選択します(図3A)。画像取得を 128 x 16 ピクセルの画像 (31.25 Hz) または同様の構成に設定します。スキャン領域をコーン端子に制限して、外側のセグメントで光顔料が漂白しないようにします。
      注: TN-XL カルシウム センサーの場合 (Ca²⁺ 結合の場合は τ = ~0.6 秒、Ca²⁺ 結合解除の場合は τ = ~0.2 秒)、~8 Hz の最小フレーム レートが推奨されます。
   7. 光刺激と記録
      1. サブステージのフルフィールド光刺激装置を使用して、次の手順を実行してください。
         注：フルフィールド光刺激装置の簡単な解決策は、マウスコーンの波長感度に一致しながらも、同時に蛍光検出に使用されるフィルターと重ならないように、2つのバンドパスフィルター付きLED（例えば、"青"：360バンドパス）BP12、"緑"）578BP10％を使用することです。 LEDからの光は、コンデンサーによって記録チャンバーの底部に集光されます(図2)。
      2. レーザーをオンにし、光刺激(2.2.3を参照)を提示するか、薬理学的薬剤を適用する前に、コーンがスキャンレーザーと刺激背景光(20〜30秒)に適応するのを待ちます。
      3. 任意の刺激(例えば、図3B、Cに示すように、光の閃光)の提示を開始する。ステップ2.2.1で説明した刺激装置の場合、カスタマイズされたソフトウェアによって制御されるマイクロプロセッサボードを使用して、2つのLEDの強度を経時的に変調することにより刺激を生成します。
      4. 2つの蛍光チャネルの記録を開始します(たとえば、「青」の場合は483 nm)
   8. Förster共鳴エネルギー移動(FRET)-ドナーeCFPおよび「黄色」FRETアクセプターの場合は535nm)で、それぞれの画像取得ソフトウェア(2.1.6も参照)を同時に使用します。たとえば、光の点滅(図3B、C)の場合、少なくとも8〜10回の刺激提示(試行)を記録します。

結果

Figure 1.垂直網膜スライスの調製。(A)スライス用に準備された孤立して平らにされた網膜。(B)スライス後に濾紙膜(ダークグレー)に取り付けられた長方形の網膜(Aの赤いボックスを参照)。(C)グリースを使用してガラスカバースリップに固定された膜に取り付けられた網膜スライスの上面図。(D)網膜スライスの一部の概略図(Cの赤いボックスを参照)。コーンの視細胞は緑色で示されています...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
高真空グリース	ダウ・コーニング	1018817	http://www.dowcorning.com
カバースリップ	R.ランゲンブリンク		24 x 60 mm;http://www.langenbrinck.com
スライドガラス	R.ランゲンブリンク		76 x 26 mm;http://www.langenbrinck.com
組織チョッパー用ブレード	MARTOR KG	アルゼンチンタックスNo.1044	0.25 mm;http://www.martor.de
組織チョッパー	カスタムビルド
ニトロセルロースフィルターメンブレングリッドド	メルクミリポア	AABG01300	フィルタータイプ:0.8μm;http://www.emdmillipore.com
UV/緑色LEDベースのフルフィールド刺激装置	カスタムビルド
オープンソースマイクロプロセッサボード	Arduino		http://www.arduino.cc
イメージングソフトウェア CfNT	カスタムライティング		Developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 システムフォーカル灌流システム	ALA科学機器		With 100直径μmのチップマニホールド。http://www.alascience.com/
マイタイHP DeepSee (Ti:サファイアレーザー)	ニューポートスペクトル物理学		http://www.spectra-physics.com
可動式対物顕微鏡 (MOM)、W. Denk、MPImF、ハイデルベルク、ドイツ	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
XLUMPlanFL 20x/0.95w 対物レンズ	オリンパス		http://www.olympusamerica.com
ライカMZ95	ライカマイクロシステムズ		http://www.leica-microsystems.com/