ゼブラフィッシュ網膜再生中のMuller Glial核遊走のライブセルイメージング

要約

出典: Lahne, M., et.al.多光子顕微鏡による生細胞イメージングのための成体トランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の培養。J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、光誘起視器損傷後のアガロース包埋ゼブラフィッシュ網外植片におけるミュラーグリア核遊走の生細胞イメージングを示しています。損傷した光受容体から放出される腫瘍壊死因子-α(TNF-α)は、ミュラーグリア細胞を活性化し、内核層と外核層を介した核移動を引き起こして、有糸分裂とニューロン前駆細胞の生成を行います。撮影された画像は、網膜再生中の核移動と前駆細胞の分化のダイナミクスを明らかにしています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.多光子顕微鏡

注: この原稿で行われた実験は、赤外線レーザー(Table of Materialsを参照)、40X Apo長距離水浸対物レンズ(N.A. 1.15)、検流計スキャナー、および4つの35mmシャーレ用のインサートを含む環境チャンバーを備えた多光子顕微鏡用に最適化されています。画像は、ノンデスキャン検出器(R-NDD)で取得しました。

1. イメージングの前に、環境チャンバーを平衡化して、5% CO₂/空気雰囲気を達成します。部屋へのガス漏れを防ぐために、空のペトリ皿がホルダーに挿入されていることを確認してください。
2. 顕微鏡システムの電源を入れます。
3. 環境チャンバーが平衡化したら、屈折率の高い液体を40X Apo長距離水浸対物レンズ(N.A.1.15)に加えます。
   注: 水と同様の光学特性を持つ屈折率液体は、長期イメージング中の水の蒸発を防ぐために使用されます。
4. レチナール外植片を含むフルオロディッシュをチャンバーに入れます。明視野光を使用して、標本を光路に配置し、背側網膜の中央領域を焦点面に持ってきます。
5. GFP脱毛蛍光光を使用して、gfap:nGFP陽性のミュラーグリア核(図1A、C)に焦点を合わせます。
   注:外植片が平らに取り付けられていないか、外植片の下にアガロースが蓄積されている場合、gfap:nGFP陽性の核に焦点を合わせるのが難しくなります。そうしないと、薄暗く蛍光を発します。
   1. 同じ網膜外植片内の別の領域に移動することで、焦点合わせの問題が克服されるかどうかを確認します。それ以外の場合は、別の網膜外植片に移動します。
6. 画像取得ソフトウェアで、「A1 MP GUI」、「TiPad」、「A1 Compact GUI」、「ND acquisition」の各ウィンドウを開きます。多光子イメージングの場合は、「A1 Compact GUI」で「IR NDD」オプションが選択されていることを確認してください。
7. 「設定」フィールドで、第1ダイクロイックミラーにIR-DMを選択し、バンドパスフィルター525/50を選択してGFP蛍光を取得します。
8. 「A1MP GUI」というラベルの付いたウィンドウでIRレーザーをオンにします。レーザーの準備が整うまで数分かかります。波長を910 nmに設定してGFP蛍光を励起し、「A1 MP GUI」ウィンドウの「Auto alignment」ボタンをクリックしてレーザーを位置合わせします。
9. 「A1 MP GUI」でシャッターを開く前に、光電子増倍管の露出オーバーを避けるために、部屋と機器の照明がオフになっているか覆われていることを確認してください。騒音レベルを下げるには、顕微鏡を暗い環境に保管してください。
10. 300 x 300 ピクセルの視野、2 回のズーム、4.8 μs/ピクセルのピクセル滞留時間の画像を取得します。「A1MP GUI」の「取得領域」と「A1 Compact GUI」ウィンドウのゲインを変更して、レーザー出力を大まかに設定します。
11. zスタックの設定
    1. 神経節細胞層(GCL)に焦点を当てて、「ND取得」ウィンドウ内の「z」サブウィンドウでzスタックの上部焦点面を設定します。一部のgfap:nGFP陽性細胞は通常、神経節細胞層に位置し、網膜の基底限界を特定するのに役立ちます(図1A、D)。
    2. 焦点面を外側の核層(ONL)のレベル(図1A、B)に通して動かします。これは、内側の核層(INL)の対応する細胞に比べて丸く拡大した、薄暗くラベル付けされたgfap:nGFP陽性細胞の存在によって特徴付けられます(図1A、 C)です。
    3. この平面を Z スタックの一番下に設定します。ONL 全体がイメージ化されることを確認します (図 1A、B
    4. イメージング期間中に再調整が必要な焦点面のシフトが発生した場合は、「z」サブウィンドウの中央の位置をダブルクリックして、「ホーム」位置として割り当てます。「対称モードの定義」に変更し、「relative」をクリックします。
    5. Zステップサイズを0.7〜1μmの間で設定します。
12. Z強度補正:
    1. 組織の深層でイメージングする際に、光散乱によるピクセル強度の損失を補正するためにZ強度補正を適用します。
    2. 補正を設定するには、「z強度補正」ウィンドウを開きます。「z-stack range」を設定するには、「From ND」を選択します。
    3. 「z-intensity correction」ウィンドウ(この場合は神経節細胞層に相当)で下部の焦点面をクリックし、レーザー強度(「A1MP GUI」の「取得領域」)とゲイン(A1 Compact GUI)を設定します。
    4. 「z-intensity correction」ウィンドウの「z-values」の横にある矢印をクリックして、選択した焦点面の「z-intensity correction」ウィンドウの「device settings」に表示される設定を確認します。
    5. 中間面と上面に対してこのプロセスを繰り返し、レーザー出力とゲインを上げます。必要に応じて、焦点面を追加できます。図 1 - 3 の実験の特定のレーザーとゲイン設定については、表 1 を参照してください。
    6. 「A1 MP GUI」ウィンドウで「取得エリア」を設定します。イメージングの開始時に15より大きい取得領域と126を超えるゲインを選択することは避け、光退色やノイズレベルの増加を回避します。
       注: レーザーと光電子増倍管は顕微鏡システムによって異なるため、レーザーとゲインの設定をテストして、光退色を避けながら顕微鏡のセットアップに最適なイメージング条件を取得してください。
    7. 「z強度補正」ウィンドウで「相対強度補正」を選択します。
13. 「ND acquisition」ウィンドウの「timeseries」サブウィンドウで、期間を 8 時間に設定し、間隔を「遅延なし」に設定します。次に、「ND取得」ウィンドウボタンの「zスタック」サブウィンドウにある「z補正の実行」をクリックして、3次元時系列を取得してください。
14. 画像取得の期間中、網膜外植片を27〜29°Cの温度に保ちます。
15. 画像取得期間中、必要に応じて、イメージング後の解析で画質を維持するために、パワーレベルとゲインを再調整します。調整するには、手順 1.11.2 から 1.11.4 を実行します。
16. 焦点面がずれた場合は、実行を一時停止または停止し、手順1.11を再度実行します。
    注: ステップ1.12.7で「相対z補正」を選択し、ステップ1.11.4を実行した場合、広範な光退色が発生しない限り、パワーレベルとゲインレベルを再調整する必要はありません。

表1:図1〜3に示す実験のさまざまな平面でのz強度補正に使用されるレーザーレベルとゲインレベル。

	Tg[gfap:EGFP]nt11		Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19
	レーザーパワー	ゲイン	レーザー出力	ゲイン
トップ(桿体感細胞)	13	126	3.5	118
ミドル(ミュラーグリア)	10	126	2.8	118
ボトム(神経節細胞層)	8	126	2.1	118

結果

Figure 1: 3-D Reconstruction of Retinal Multiphoton Z-Stacks.A) ゼブラフィッシュの網膜全マウント培養におけるgfap:nGFP陽性細胞の多光子zスタック画像シリーズの3D再構成 (48時間後の光損傷)。B - D)(A)の3D再構成で表示されたgfap:nGFP陽性細胞の単一多光子xy画像(ONL(B

材料