トランスフェクションされた初代マウス大脳皮質細胞のタイムラプスイメージング

要約

出典:Landeira, B. S.,et al., Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System.J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、タイムラプスイメージングを使用して、蛍光標識された皮質前駆細胞を追跡し、それらの分裂と分化を監視し、初代大脳皮質細胞の系統発達を研究する方法を示しています

プロトコル

1. タイムラプスビデオ顕微鏡法

注: このステップには、インキュベーションチャンバーを備えた倒立蛍光顕微鏡が必要です(Table of Materialsを参照)。

1. レトロウイルス感染後、組織培養プレートを温度コントローラーとCO₂コントローラーに接続されたインキュベーターに入れます。
   注: イメージングを開始する前にチャンバーを3時間予熱すると、取得中のドリフトと焦点ぼけを最小限に抑えるのに役立ちます。
   注: チャンバーは、細胞を 37 °C および 5% CO₂ の一定の条件に維持する必要があります。
2. ゼロ点(XY = 0)として機能するXY軸の位置を選択します。これにより、参照は将来再び位置を見つけることができます。
   注: 零点を決定するための基準として使用できる記号をプレートに描くことをお勧めします。
3. 10倍の倍率で撮影する位置を選択します。
   注: レトロウイルストランスフェクション細胞を観察する可能性を高めるために、ウェルごとに10-15の位置を選択してください。
   注: 長距離高倍率対物レンズ (20X または 40X) を使用して、より高解像度の画像を取得できます。対物レンズの作動距離によっては、ガラス底板が必要になる場合があります。
4. 5分ごとに位相差画像を取得し、3時間ごとに蛍光画像を取得して、光毒性を減らします。実験の最初の3時間では、温度が平衡化している間に焦点が変化する可能性があるため、焦点を確認して調整します。毎日ピントを確認して調整します。
   注: 最初の24時間後に焦点が安定することがわかります。ただし、フォーカスを監視することをお勧めします。または、ソフトウェアベースのオートフォーカスシステムを使用します。
5. 7 日後、取得を停止します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ImageJ	NIH
tTt	ETH チューリッヒ
セルオブザーバー顕微鏡	ツァイス
トラッキングツール(tTt)ソフトウェア		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html