共焦点マクロスコピーを用いた出生後小脳顆粒細胞遊走の Ex vivo イメージング

要約

出典:Bénard, M., et al. Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy.J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、出生後のラット脳の小脳切片中の顆粒細胞のex vivoの移動を追跡する共焦点巨視的方法を示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 生きている介在ニューロンの蛍光染色

1.大口径ガラス製の切り捨てられたパスツールピペットで小脳スライスを6ウェルプレートに移します(最大3スライス/ウェルあたり)。ハンクス平衡塩溶液(HBSS)培地を吸引します。

2. 蛍光色素のローディング溶液5ml(最大3個)でスライス(最大3個)をインキュベートします。

3. 光から保護するために、マイクロプレートをアルミホイルで覆ってください。35rpmのジャイロ移動テーブルに室温で10分間置くと、細胞の標識が容易になります。

4. Transwellインサートのメンブレン上でスライスを転写します（3.0 μmの孔径;図1D)ワイドボアガラス製の切り捨てられたパスツールピペット付き。ローディング媒体をピペットで吸引します。

5. インサートを取り外し、ウェルに1.9mlのダルベッコ修正イーグルメディウム(DMEM)を入れます。インサートを交換し、スライスの上に100 μlのDMEMを加えて組織を覆います。

6. 培養インサートを含むプレートをインキュベーターチャンバー（37°C、5%CO₂）に2時間置いて、分子層（ML）の顆粒細胞））を観察するのに十分な時間）です。ティッシュを平らに置き、インサートメンブレンに付着させます(図1E)。スライスが乾いていないことを確認してください。

2. 共焦点マクロスコピーによる生体外イメージング

1.プラスチック製の蓋をしていないプレートを、共焦点マクロスコープのスタンドに取り付けられたインキュベーターに移します。マクロスコープのプレートインサートにガラスカバーを置きます。チャンバーの温度を37.0°C±0.5°Cに保ち、プレートインサートを介して一定のガス流量(95%_O2、5%_CO2)をスライスに供給して、pHを一定に保ちます。タイムラプス実験の前にさらに2時間待ちます。

2. 組織切片中のGC移動を可視化するには、X2ドライ対物レンズ(作動距離:39 mm、直径:58 mm、NA = 0.234)を装備した共焦点レーザー走査マクロスコープを通じて、レーザーダイオードを用いて488 nmの波長光で調製物を照らし、500〜530 nmの蛍光発光を検出します。

1. GCの動きを細かく解決するために、1.5から2.0の光学ズーム係数を追加で画像を取得してください。1 つの焦点面、または Z 軸に沿って最大 10 の異なる焦点面で GC の画像を 30 分ごとに最大 12 時間収集します。

3. 必要に応じて、ガラスカバーを取り外し、DMEM中の生物学的活性化剤または阻害剤を少量(1-10μl)10μlのピペットで追加し、GC移動への影響を研究してください。

3. セルトラッキング

1.動画の上映時間ごとに、ImageJのecart-typeモードでzスタック投影を行います。連続する画像のコントラストと輝度レベルを調整して、ラベル付けされた GC の識別と追跡を容易にします。参照スナップショットの各位置 (t = 0) を手動でマッピングします。

1. Analyze Particle Menuの「Manual tracking」プラグインを使用し、タイムラプス中に各セル本体の重力点をクリックして決定してください。未加工のトラッキングデータをスプレッドシートにエクスポートします。

2. ImageJからエクスポートされた生のトラッキングデータを、各セルと関連する位置を識別するスマートな自家製プログラムで再編成してください。このプログラムを使用して、各セルの合計移動距離と平均移動速度を計算します。同じプログラムを使用して、適切なフィルター下で制御条件と処理条件での細胞遊走の特性を分類および比較します。

結果

図1:Ex vivo P10小脳スライスの培養。(A)P10ラットから小脳を解剖した。スケールバー = 6 mm. (B) 生体厚さ180μmの小脳スライスを立体顕微鏡で顕微鏡で撮影。スケールバー = 3 mm. (C) 高倍率では、小脳の4つの皮質層(外部顆粒層(EGL)、分子層(ML)、プルキンエ細...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)栄養混合物 F-12	Sigma-Aldrich	D8437
Cell Tracker Green CMFDA	Invitrogen	C2925
ポリエステルトランスウェルクリアインサート	コーニング	3452
6ウェル細胞培養クラスター	コーニング	3516
DMSO	フィッシャーサイエンティフィック	BP231-100
ジャイロロッカー、SSL3	スチュアート
CO₂インキュベーター、 Hera Cell 150	サーモサイエンティフィック
共焦点マクロスコープ、TCS LSI	ライカマイクロシステムズ
CO₂-controller	PeCon
ハンクの平衡塩溶液10x	シグマ・アルドリッチ	H1641
容量可変ピペット(0.5-10μL)	エッペンドルフ	4910 000.018
温度コントローラー	PeCon