共焦点顕微鏡を用いたマウス神経幹細胞分裂のタイムラプスイメージング

要約

出典:Daynac, M., et.alです。成体マウス脳室内ゾーンからの神経幹細胞および前駆細胞の細胞選別とそれらの細胞周期ダイナミクスのライブイメージング。J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、トランスジェニックマウス脳からの神経幹細胞(NSC)のタイムラプスイメージングを示しています。NSCは、G1期には赤色に蛍光を発し、他の細胞周期期では蛍光を発しません。接着したNSC培養物をイメージングチャンバーに入れ、イメージングパラメータを設定し、所望の期間、一定の間隔で画像を撮影します。

プロトコル

1. 培養およびビデオ顕微鏡検査を行う前の基本セットアップ

1. 共焦点ビデオ顕微鏡検査には、ガラス底の培養プレートまたはμプレートを使用します。1 - 5 x 10³セル/ウェルの場合は96ウェルプレートを使用し、5 x 10³セル/ウェルを超える場合は24ウェルプレートを使用します。
2. 実験開始の少なくとも1日前に、接着性単層培養用の滅菌Poly-D-リジン(PDL)コーティングプレートを調製してください。十分なPDL(蒸留水またはdH₂Oに10 μg/ml)を加えて各ウェルの底をコーティングし、37 °Cで一晩(O/N)インキュベートします。PDL溶液を取り出し、dH₂Oで3回すすいでから、プレートをフード内で少なくとも2時間、層流の下で乾燥させます。すぐに使用しない場合は、コーティングされたプレートを-20°Cで保管してください。
3. 神経幹細胞(NSC)基礎培地とNSC増殖サプリメントを9:1の比率で混合し(材料表を参照)、2 μg/mlヘパリン、20 ng/ml精製ヒト組換え上皮成長因子(EGF)、および10 ng/mlのヒト組換え線維芽細胞成長因子2(FGF-2)を混合して、培地を調製します。使用前に、培地を水浴で37°Cに温めてください。
4. 脳室内ゾーン(SVZ)解離のために、パパイン溶液を準備します:0.2 mg / mlのL-システイン、0.2 mg / mlエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および0.01 mg / mlのDNase Iを含むEarl's Balance Salt Solution(EBSS)中のパパイン(15 UI / ml)。.溶液を0.2μmのフィルターに通して滅菌します。使用前に溶液を37°Cで平衡化してください。
5. 酵素反応を停止するには、プロテアーゼ阻害剤溶液(Ovomucoid)を準備します:ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM):0.7 mg / mlトリプシン阻害剤II型を含むF12培地。0.2 μmフィルターを使用して溶液をろ過します。
6. 脳を採取するためのPBS 0.6%グルコース溶液と、洗浄ステップおよび抗体染色のためのPBS 0.15%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を調製します。
7. 解剖ツールを準備します:はさみ、解剖および結束鉗子、メス。それらを70%エタノールに浸します。

2.成体マウスの脳とSVZマイクロダイセクションの採取

1. 成体蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)マウス(生後2〜3ヶ月および/または老化研究の場合は12ヶ月齢)を犠牲にし、適切な施設ガイドラインに従って子宮頸部脱臼を行います。
2. マウスに70%エタノールをスプレーし、鋭利なハサミで頭を切り落とします。
3. 頭皮に沿って切開を行い、頭蓋骨を明らかにします。
4. 小さなハサミを使用して、頭蓋骨の基部から嗅球に向かって縦方向の正中線カットを実行します。ハサミの刃で下にある脳を傷つけないように注意してください。頭蓋骨の上部の開いた部分を湾曲した鉗子で取り除き、脳を露出させます。
5. PBSに0.6%グルコースを含む15mmのシャーレに脳を集めます。
6. 嗅球を解剖します。脳をその背側表面に置き、メスを使用して視交叉を介して冠状切片を作ります。
7. 解剖顕微鏡下で、脳切開部の吻側部分を、切断された冠状表面を実験者に向けて上に向けて配置します。
8. SVZを解剖するには、細かい湾曲した鉗子で中隔を切除し、細い鉗子の片方の先端を心室のすぐ隣接する線条体に挿入し、SVZを周囲の組織から切り離します。解剖したSVZを1mlのPBS-0.6%グルコースを含むシャーレに入れます。

3. SVZ組織解離

1. 解剖したSVZをペトリ皿で大きな破片がなくなるまでミンチにします。
2. ミンチ組織をPBS-0.6%グルコースとともに15 mLチューブに移し、200 x gで5分間遠心分離します。
3. 上清を捨て、0.01 mg/ml DNase I.を添加した予熱したパパイン1 ml(1 mg/mL、ステップ1.4で調製)を加えます。37°Cの水浴で10分間インキュベートします。マウス1匹につき1 mLのパパインを使用します。
4. 200 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
5. 予熱したオボムコイド1 ml(0.7 mg / ml、ステップ1.5で調製)を加えて、パパイン活性を停止します。.p1000マイクロピペットチップを介して20回静かにピペッティングすることにより、ミンチ組織をさらに単一細胞懸濁液に機械的に解離します。気泡を避けてください。
6. 細胞懸濁液を新しい15 mLチューブ内の滅菌済み20 μmフィルターに通します。細胞の損失を防ぐために、セルフィルターをPBS 0.15% BSAで洗ってください。
7. 200 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てます。0.15% BSAを含むPBS100 μlに細胞を再懸濁します。

4. 細胞選別のための免疫蛍光染色

FUCCI-Redマウス(図1A)を用いた細胞選別には、以下の抗体を使用してください:CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7];CD15/LeXフルオレセインイソチオシアネート[FITC]結合およびAx647結合EGFリガンド。

注:LeX⁺EGFR⁺細胞およびEGFR⁺細胞は、成体SVZには豊富ではなく、それぞれ600細胞/マウス≈および1500細胞/マウスです。十分な材料を得るために、2〜3匹のマウスからSVZ細胞をプールすることをお勧めします。細胞のソーティング時間が3時間を超えないように、同じ日に12匹を超えるマウスで作業しないでください。同じ日に多くのマウスと作業すると、細胞の選別時間が長くなり、細胞死や細胞分化が増加する可能性があることに注意してください。

1. マウスあたり100 μlのPBS 0.15% BSAでFACS染色を行います(最適な染色を行うには、2〜3匹のマウスのグループでは200 μl)。
2. コントロールチューブを準備します。コンペンセーションビーズを使用して、メーカーのプロトコルに従って単色制御チューブを調製します。細胞の一部(1匹のマウスから抽出した細胞の1/10で十分です)を選択し、4つのチューブに分離して、1本のネガティブコントロールチューブ(マークされていない細胞)と3本の蛍光マイナス1(FMO)コントロールチューブを調製します。チューブあたり200 μlのPBS 0.15% BSAに細胞を再懸濁します
   ヒント:LeX-FITC FMOコントロールの場合は、CD24-PC7(1:50)およびAx647-conjugated EGFリガンド(1:200)で細胞を標識します。CD24-PC7 FMOコントロールの場合は、CD15/LeX-FITC(1:50)およびAx647標識EGFリガンド(1:200)で細胞を標識し、Ax647標識EGFリガンドFMOコントロールの場合は、CD15/LeX-FITC(1:50)およびCD24-PC7(1:50)で細胞を標識します。
3. 細胞ソーティングに使用するチューブには、PBS 0.15% BSAで指定の希釈率で、CD24-PC7(1:50)、CD15/LeX-FITC(1:50)、およびAx647標識EGFリガンド(1:200)の抗体を使用してください。
4. 暗所で4°Cで20分間インキュベートします。1 mLのPBS 0.15% BSAで洗浄し、200 x gで10分間遠心分離します。脳あたり200 μlのPBS 0.15% BSAに細胞を再懸濁します。細胞選別チューブを氷の上に置いたまま、すぐに細胞選別に進みます。
5. FUCCI-Greenマウスを使用する場合は、LeX-FITC抗体がFUCCI-green蛍光と同じ発光波長を共有するため、細胞ソーティングの前に分離カラムを使用してLeX陽性画分とLeX陰性画分を分離します(図2A、B)。
   1. まず、マウスの抗ヒトLeX抗体(1:50)で細胞を標識し、4°C、暗所で100μlのPBS 0.15% BSAで15分間
   。
   2. 細胞を1 mLのPBS 0.15% BSAで洗浄し、200 x gで10分間遠心分離した後、抗マウスIgMマイクロビーズ(1:10)で細胞を標識し、暗所で4°Cで15分間
   。
   3. 細胞を1 mLのPBS 0.15% BSAで洗浄し、200 x gで10分間遠心分離し、細胞を500 μl PBS 0.15% BSAに再懸濁し、図2Cに示されているように、磁場中の分離カラムに細胞を注ぎます。カラムを 1 mL PBS 0.15% BSA で洗浄し、LeX 陰性画分を得ます。
   4. LeX陽性画分を得るには、分離カラムを磁界から取り出し、2 mLのPBS 0.15% BSAで細胞を溶出します。
   5. 4.2に示されているように、CD24-PC7およびAx647標識EGFリガンド染色に進みます。

5. 細胞ソーティング

に関する注意:細胞は、86μmノズルを備えた40 PsiのFACSソーターでソーティングしました。蛍光は、520/35nm(FITC)、575/26nm(PE)、670/20nm(Ax647)、および740LP(PC7)のフィルターセットを使用して収集しました。FUCCI-赤色蛍光の発光スペクトルとPC7色素との間に重複が見られるため、偽陽性のシグナルを防ぐためには補正が必要です。

1. 細胞選別の直前に、生細胞と死細胞を区別するために重要な色素を添加します。Hoechst(HO)(材料表を参照)を最終濃度2 μg/mLで使用しました。ネガティブコントロールチューブ(マークされていない細胞)をFACSソーターに通し、側方散乱光(SSC)および前方散乱(FSC)パラメータ(図3A)を使用して細胞を選択します。
   注:HOネガティブフラクションのみをゲーティングして死細胞を除外し(図3A)、次にパルス幅ネガティブフラクション(図3A)を選択してダブレットを除外しました。
2. 手順4.2で準備した単色コントロールを実行し、必要に応じて光電子増倍管(PMT)の電圧を調整します(つまり、負の集団が高すぎる、および/または正の細胞がスケールから外れている)。ソフトウェアの補正ウィンドウで色補正を実行します。
3. ステップ4.2で準備したFMOコントロール(LeX-FITC FMO control、CD24-PC7 FMO control、Ax647-conjugated EGF ligand FMO control)を実行し、ソーティングゲートを描画します(図3)。細胞を1.5 mLマイクロチューブ中の100 μlの培養液に直接選別します。

6. 顕微鏡用細胞の調製

1. Poly-D-Lysine-coated 96-well のμ-Plateに、1 - 3 x 10³細胞/ウェルの密度で選別したばかりの細胞を、300 μlの培養培地でプレートします。
2. ビデオ顕微鏡検査の前に、培養プレートを37°Cおよび5%_CO2で少なくとも1時間インキュベートして、細胞接着を可能にします。

7.顕微鏡のセットアップと画像取得

1. Plan Apo VC 20x DIC対物レンズ(NA:0.75)を使用して、5%_CO2雰囲気下で37°Cの倒立サーモステーテッドチャンバーに取り付けられた共焦点レーザー走査型顕微鏡システム上でライブイメージングを行います。
2. 96ウェルμプレートを予め加温して平衡化されたサーモステーテッドチャンバー内に置き、蓋をサーモステーテッドカバーと交換します。
3. NIS-Elementsソフトウェアを開き、メニューバーの「Acquire/Acquisition controls/ND acquisition」をクリックしてタイムラプスのオプション(長さ、ステージ位置、共焦点zセクション,...)、対物レンズを選択する「Acquire/Acquisition controls/Ti Pad」、メニューバーで各蛍光のPMTレベルを選択する「Acquire/Acquisition controls/A1plus Settings」をクリックします。データファイルを保存するフォルダを選択します。
4. ND取得ウィンドウを使用して、各ウェルの中心をステージ位置として設定し、大きな画像オプションを7 x 7 mm²に選択します。これにより、各ウェルの中央の周りにモザイク画像が作成されます。大きなモザイク画像のオーバーラップを 5% に設定します。24時間、20分ごとに写真を撮ります。Ti Pad ウィンドウで Plan Apo VC 20x DIC 対物レンズ (NA: 0.75) を選択します。
5. A1plus設定ウィンドウで、高速レゾナントスキャナーを使用して、512 x 512ピクセル形式、解像度1.26μm/ピクセルの画像を取得します。明視野を使用してセルの形状を視覚化します。FUCCI-Redマウスの場合、561 nmで赤色蛍光を励起し、595/50 nmフィルターを使用して収集します。FUCCI-Greenマウスの場合、488 nmで緑色蛍光を励起し、530/40 nmフィルターを使用して収集します。各波長の最適なPMTレベル、オフセット、レーザー出力を決定します.
   注:明視野チャネルのオートフォーカス機能を使用して、ソフトウェアが各取得前に各ステージ位置でオートフォーカスできるようにすることをお勧めします。ヒント:Plan Apo VC 20x DIC対物レンズ(NA:0.75)は、オイルを必要とせずに優れた解像力を発揮して使用されました。他の対物レンズは、所望の光学分解能に応じて使用され得る。
6. ND取得ウィンドウの[今すぐ実行]ボタンを選択して、取得を開始します。

結果

Figure 1: FUCCI-Redマウスを用いた細胞周期のライブ解析 (A) G中に細胞が赤色蛍光を発するFUCCI-Red細胞周期の模式図₁相で、S-G₂ / M相中は無色です。(B)SVZ細胞上のFUCCI-Red蛍光のFACS表現。(C、D)若年(C)および中年(D)のFUCCI-Redマウスから選別したLeX⁺EGFR⁺およびEGFR⁺細胞を用いたビデオ顕微...

材料