動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
注:このプロトコルは、ウイルス注入手術、勾配屈折率(GRIN)レンズインプラント手術、GRINレンズインプラント手術、GRINレンズインプラントの検証、ベースプレートの取り付け、GCaMP(緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン(CaM)、およびM13、ミオシン軽鎖キナーゼからのペプチド配列)シグナルの光学記録、および動作試験中のデータ処理(図1A)の6つの主要なステップで構成されています。).手術以外は、商用ソフトウェアパッケージ(Inscopix)を使用します。
1.脳定位固定装置手術 - アデノ随伴ウイルス(AAV)注射
注:この外科的処置で使用されるマウス系統はC57BL6/Jです。手術中、動物の体は滅菌ドレープで覆われ、プロトコルのすべてのステップは滅菌手袋を着用して実行されます。通常、複数の手術が同じ日に行われることはありません。ただし、複数のマウスが同じ日に同じ手術を受けなければならない場合は、マウスごとに別々のオートクレーブ滅菌された手術器具のセットと70%エタノールを使用して、マウス間で手術器具を消毒します。手術中にマウスを暖かく保つために、マウスを脳定位固定装置フレームに固定した後、カスタムメイドの手術用ブランケットで覆います。
- 必要なすべての手術器具を70%エタノールで消毒し、ハミルトンシリンジとガラスピペットを準備します。ガラスピペットに蒸留水を入れます.
注:プロトコルで使用されるすべての手術器具はオートクレーブ滅菌されています。GRINレンズと頭蓋骨ネジはオートクレーブ滅菌ができないため、消毒剤として70%エタノールを使用し、炎症を予防しています。試されていませんが、ガス滅菌や化学滅菌など、他の形態の滅菌が使用される場合があります。 - マウスにペントバルビタール(体重83mg・kg-1)を腹腔内注射で麻酔します。マウスが意識を失ったら、頭蓋骨の毛皮を剃ります。
- 頭蓋骨の上の皮膚を70%エタノールで洗浄し、マウスを定位固定装置フレームに固定します。慎重に皮膚を取り除き、綿先のアプリケーターを使用して35%過酸化水素溶液で頭蓋骨の表面を拭きます。手術中の角膜の乾燥を防ぐために潤滑剤眼軟膏を塗布してください.
注:通常、無菌皮膚の準備にのみ70%エタノールを使用しても問題ありませんが、ヨードフォアやクロルヘキシジン溶液などの消毒剤と70%エタノールを3回交互に使用することをお勧めします。このプロトコルでは、マウスの頭蓋骨の結合組織が可能な限り完全に除去されるように、高濃度の過酸化水素が使用されていますが、これは、頭蓋骨の結合組織がベースプレートの頭蓋骨へのしっかりとした取り付けを妨げるため、後のイメージング中に運動アーチファクトを減らすために重要です。35%の過酸化水素は、通常使用されるもの(3%)よりもはるかに高いことに注意する必要があります。 - ピンを脳定位固定装置用プローブホルダーで固定します。ブレグマとラムダの高さをピンに合わせます。
- 開頭術のためのマウスの頭蓋骨上の特定の位置を見つけます.
注:ウイルス注射のための外側扁桃体(LA)の座標は、(AP、ML、DV)=(-1.6 mm、-3.5 mm、-4.3 mm)このプロトコル(AP;前部後部、ML;内側外側、DV;背側-腹側、各略語はブレグマからの相対的な軸方向距離を示します)。座標は、各実験条件に対して最適化する必要があります。 - 頭蓋骨の表面をドリルで開けます(図1B)。頭蓋骨画分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。鉗子または27Gの針を使用して残りの層を取り除きます。
頭- 蓋骨を穴あけするときは、脳組織の表面を傷つけないように、最後の硬膜層に触れないようにしてください。損傷した脳表面は水膜の周囲に炎症を引き起こし、記録中に重度の運動アーチファクトと高い自家蛍光を誘発します。開頭術は1.6mmです。ドリル速度は18,000rpmで、ビットサイズは0.6mmです。
- 穿孔部位の脳組織表面から目的の扁桃体部位までGRINレンズを下げるためには、ブレグマを基準に設定されたレンズ埋め込みのDV座標からブレグマと露出した脳表面とのDV差を差し引いて「Value A」と名付けられた距離を算出します(この場合は4.2mm、 図1C)。
- 3 μL の鉱油と 0.7 μL の AAV ウイルス溶液をガラスピペットにロードします。
注: 鉱油はウイルス溶液と水を分離するのに役立ちます。0.7 μL は、LA を完全にカバーできる LA ウイルス注射に最適な容量です。 - 脳定位固定装置用プローブホルダーからピンを取り外し、ガラスピペットを固定します。
- 手順1.5で説明した注射部位にガラスピペットを配置します。出血が完全に止まった後、ガラスピペットを脳組織に挿入します。
- 注入ポンプを使用してガラスピペットを通してウイルスを送達します.
注:ウイルスの力価は、十分な数のGCaMP発現細胞を得るために1 x 1013 vg / mLより高くなければなりません。注入速度は0.1μL/minで、10分間拡散します。出血がある場合は、PBSで脳の表面を洗ってください。このステップでは、脳の表面を濡らしておきます。 - 注入が終わったら、ガラスピペットをゆっくりと取り外します。
2.脳定位固定術 - GRINレンズの埋め込み術
注:GRINレンズのインプラント手術は、このプロトコルで最も重要なステップです。GRINレンズの埋め込みを成功させるには、GRINレンズの動きを一貫してゆっくりと動かすことが重要であるため、電動手術アームが役立ちます。電動手術アームは、コンピュータソフトウェアによって制御される定位固定装置です。このプロトコルでは電動アームが使用されますが、移植中にレンズが一貫してゆっくりと動く限り、他の方法も使用できます。デバイスに関する詳細情報は、資料の表にあります。
- 頭蓋骨に穴を開けて、2本の頭蓋骨ネジを埋め込みます。すべての頭蓋骨画分をPBS.
注:後の光学イメージングでモーションアーチファクトを減らすには、少なくとも2本のネジが必要です。2本の頭蓋骨ネジとGRINレンズインプラントの位置は、正三角形を形成しています(図1B)。開頭術のサイズは、ネジの直径にぴったりと収まる必要があります。にじみがある場合は、にじみのある表面をPBSで洗ってください。ドリル速度は18,000rpmで、ビットサイズは0.6mmです。 - 炎症を防ぐために、ネジを70%エタノールで消毒します。ネジをできるだけ深く埋め込みます.
注:ネジは、セメントなどの追加の接着なしでしっかりと固定する必要があります。 - 電動手術アームを脳定位固定装置フレームに取り付けます。制御ソフトウェアがインストールされているラップトップコンピューターに必要なハードウェアを接続します(資料の表)。
- GRINレンズを下げる前に、26Gの針で針の軌跡を作る準備をしてください
注:針の軌跡は、比較的厚いGRINレンズを扁桃体などの脳深部領域に埋め込むのに役立つガイドトラックの一種です。このガイドトラックは、比較的細い26Gのニードルを下げて昇降させることで作られているため、ニードルトラックと呼ばれています。 - カニューレホルダーを取り付けて、定位固定装置フレームに針を安定して保持します。
- カニューレホルダーで26Gの針をつかみ、針挿入部位の座標を計算します.
注:このプロトコルでは、針挿入部位の座標は、ウイルス注入部位(AP、ML、DV)から横方向に50μmです=(-1.6mm、-3.55mm、-3.7mm)。 - 制御ソフトウェアにアクセスし、針の位置を操作するための完全な準備を行います。
- 制御ソフトウェアを実行し、制御セッションを開始するために新しいプロジェクトの開始ボタンを選択してください。
注：制御セッションには、いくつかの空白のボックスとメニューボタンがあります。空白のボックスは、座標の入力スペースです。空白のボックスに座標を入力した後、Go Toボタンをクリックして電動定位アームが動きます。Go Toボタンは、脳定位固定装置アームが動いているときにSTOPボタンに変わります。いくつかのメニューボタンの中で、このプロトコルではツールボタンのみが必要です。 - [ツール]ボタンをクリックします。[フレームのキャリブレーション]メニューボタンをクリックして、制御ソフトウェアをキャリブレーションします。キャリブレーションは、マニピュレーターの実際の位置をステレオドライブソフトウェア上の値として設定するプロセスです。
- 定位固定装置マニピュレーターを使用して、頭蓋骨表面の露出した脳表面に針の先端を配置します.
注:針の速度は、ツールメニューのマイクロドライブ速度メニューを使用して設定します。デフォルトの速度は 3.0 mm/s です。ただし、このステップでは 0.5 mm/s の速度をお勧めします。針の動きは矢印キーで制御します。 - 脳の表面を濡らしたままにするために、PBSを2〜3滴加えます。コンピュータ画面の空白のボックスに、LAの適切なDV座標を入力します。脳の表面が乾燥していると、針が脳組織に浸透するのを妨げます。
- [Go To]ボタンをクリックして、26 Gの針を下げます。DV座標で設定された対象部位に針が到達すると自動的に停止します。針の速度は100μm/minです。出血がある場合は、STOPボタンをクリックして針を止め、PBSで脳表面を洗います。このステップでは、脳の表面を濡らしておきます。出血が止まったら、再び下降を開始します。
- 針の動きが完全に停止したら、コンピューター画面の空白ボックスに45.00 mmを入力します。
注:45.00 mmは、針を開始位置に戻すDV座標の値です。 - 「Go To」ボタンをクリックして、針を持ち上げます。針の動きの速度は100-200μm/minです。
- 針の動きが止まったら、脳表面のPBSを取り除きます。針とカニューレホルダーを脳定位固定装置フレームから取り外します。実験者は、必要に応じてSTOPボタンをクリックすることで、手動で針を停止できます。
- 脳定位固定装置ロッドにレンズホルダーを取り付けます。GRINレンズをレンズホルダーに取り付けます。
注:このプロトコルでは、LAをターゲットにするために最適化されたGRINレンズ(直径0.6 mm、長さ7.3 mm)が使用されます。レンズホルダーが準備されていない場合は、ブルドッグクリップを使用してGRINレンズをつかむ方法もあります。 - 70%エタノールでレンズを消毒し、脳定位固定装置フレームに脳定位固定ロッドを取り付けます。
- GRINレンズの先端を頭蓋骨表面の指定された場所に配置します(手順2.8で説明したのと同じ方法).
注:GRINレンズの座標は(AP、ML、DV)=(-1.6 mm、-3.55 mm、-4.2 mm)(図1C)です。レンズは、先端の損傷を避けるために頭蓋骨に触れないようにしてください。 - 手順2.16で説明したレンズ埋め込みのDV座標から「Value A」の絶対値を差し引いてDV座標を計算します。
- 脳の表面にPBSを2〜3滴落とします。コンピューター画面の空白のボックスに、レンズを下げるには1000μm、レンズを上げるには300μmを入力します。
- GRINレンズが目的部位に到達するまで、GRINレンズの下降(下1000μm)と上昇(300μm上)を繰り返します。この上下の手順は、そうでなければ移植経路に沿って脳構造の歪みを引き起こす可能性のあるレンズの降下手順により、脳組織内で発生する圧力を解放するために使用されます.
注:GRINレンズの動きの速度は100μm/分です。出血があってもGRINレンズの可動を止めず、PBSで脳表面を洗い流します。このステップでは、脳の表面を濡らしておきます。脳表面が乾燥していると、GRINの水晶体表面に脳組織がくっついて脳の構造が歪 んでしまいます。- GRINレンズがターゲットサイトに到達した場合は、PBSを取り外し、GRINレンズ、ネジ、およびそれらの側壁の周りに樹脂歯科用セメントを慎重に塗布します(図1D).
注:頭蓋骨全体に樹脂セメントを塗布すると、モーションアーティファクトを減らすことができます。逆に、レジンセメントが誤って頭蓋骨に付着した筋肉を覆ってしまうと、運動アーチファクトが増加します。 - レジンデンタルセメントが固まったら、レンズホルダーからGRINレンズを分解し、頭蓋骨全体にアクリルセメントを塗布します(図1D)。
- ヘッドプレートの取り付けは、レンズホルダーを脳定位固定装置ロッドから分解し、ロッドの先端にテープでヘッドプレートを取り付けます。ヘッドプレートが水平かどうかを確認します
注:ヘッドプレートが傾いていると、 view。マウスヘッドをモバイルホームケージシステム(ベースプレート取り付け部)に固定するためのヘッドプレートが必要です。実験者がシステムを使用しない場合は、このステップ (ステップ 2.22) と次のステップ 2.23 をスキップします。 - ヘッドプレートがレンズカフの上部に来るまで、ロッドをゆっくりと下げます。ヘッドプレートをさらに1000μm下げます。埋め込まれたGRINレンズのヘッドプレートを、ヘッドプレートの内部リングの右端に配置するように移動します。
注:ヘッドプレートは、埋め込まれたGRINレンズの表面よりも低く配置する必要があります。そうしないと、マイクロエンドスコープは、アクリルセメントのために焦点面を調整するために埋め込まれたGRINレンズに十分に近づくことができません。 - アクリルセメントを塗布して、ヘッドプレートをセメント層に取り付けます(図1D)。
- 埋め込みたGRINレンズ表面にパラフィンフィルムを貼り付け、レンズ表面をホコリから保護します。次に、パラフィンフィルムに取り外し可能なエポキシボンドを塗布して、パラフィンフィルムをレンズ表面に保ちます。
- 鎮痛剤であるカルプロフェン(PBSで0.5 mg / mL)、および抗炎症薬(PBSで0.02 mg / mL)溶液であるデキサメタゾンをマウスの腹腔に注射します。
注:薬物の用量は体重によって異なります:カルプロフェン(体重の5 mg・kg-1)とデキサメタゾン(体重の0.2 mg・kg-1)。カルプロフェンとデキサメタゾンはどちらも、手術後と手術後7日間は1日1回投与されます。. - 抗生物質であるアモキシシリン0.3 mg / mLを家庭用ケージ水に混合して、薬物を1週間投与します。.
- マウスを自宅のケージに戻し、回復とウイルス伝達のために5〜8週間待ちます.
注:マウスは、マウスが麻酔薬から目覚めるまで、電気毛布の上の予め温められたケージで回復します。
3. GRINレンズ移植の検証
注:GRINレンズ移植の検証は、移植されたGRINレンズがGCaMP発現細胞に対してオンターゲットであるかどうかに関する情報を提供します。この情報に基づいて、実験者は、オフターゲットのGRINレンズを移植した動物を除外することにより、行動テストやデータ処理などの時間のかかるプロセスから時間を節約します。バリデーション手順では、GCaMP発現を持つ細胞を記録視野に焦点を合わせる必要があります。このステップでは、モバイルホームケージを使用します。モバイルホームケージは、GRINレンズの埋め込みとベースプレートの取り付けの検証中に、頭部固定マウスが脚を自由に動かすことができる特殊な丸型装置です。この装置の空中昇降台は、頭部固定マウスの脚を載せたもので、頭部が固定されているにもかかわらず、このような自由な脚の動きを可能にしています。扁桃体の外側核の細胞は通常、安静状態または麻酔状態では静かであるため、これらの条件下ではGCaMP蛍光シグナルが検出されることはめったになく、GRINレンズの埋め込みとベースプレートの取り付けの検証中にGCaMPを発現する細胞を見つけることは非常に困難であり、時には不可能になります。しかし、脚部の動きは、扁桃体の外側核の細胞にGCaMP蛍光シグナルを生成することが多く、それによって顕微鏡の位置を特定するのに役立ちます。したがって、モバイルホームケージは、このプロトコルで使用される。
- 定位固定装置をモバイルホームケージシステムに組み立てます。
- マウスを1.5%イソフルランガスで麻酔します。マウスが完全に意識を失ったら、マウスをモバイルホームケージシステムのヘッドバーに置きます。
- マウスの下にあるカーボンケージを見つけます。カーボンケージを閉じてエアフローをオンにすると、ケージが摩擦なく自由に動きます。マウスがアクティブになるまで数分待ちます.
注:気流の速度は、実験条件ごとに最適化する必要があります(ここでは、100 L / min)。 - 埋め込みたGRINレンズの表面に付着したパラフィンフィルムとエポキシボンドを剥がし、レンズペーパーを用いてレンズ表面を70%エタノールで拭きます。
- データ集録(DAQ)ソフトウェア(Inscopixなど)を準備します。イメージング条件を設定します。
注:DAQソフトウェアは、顕微鏡(発光ダイオード(LED)の電力、レンズの焦点など)とデータストレージの制御に使用されます。- DAQボックスをオンにして、顕微鏡を接続してください。次に、ケーブルを使用して直接、または無線インターネット経由でラップトップコンピュータに接続します。
注:DAQソフトウェアは、DAQボックスと呼ばれる追加のハードウェア(Inscopixなど)にインストールされます。DAQボックスをラップトップコンピュータに接続すると、ラップトップコンピュータでDAQソフトウェアにアクセスできるようになります。 - インターネットブラウザからDAQソフトウェアにアクセスします(Firefoxを推奨)。
- 必要なすべての詳細(日付、マウスIDなど)を定義済みセッションで設定します。次に、[保存して続行]をクリックします。保存後、実行セッションにアクセスします。
- Run Sessionでは、露光時間、ゲイン、電子フォーカス、露光LED電力などのイメージング条件を設定します。
注:ゲインと露光LED電力は、実験室の条件に応じて変更できます。電気フォーカスの推奨値は500で、露光時間は50msです。LEDの電力とゲインの変更に制限はありません。ただし、光の強度が高いと、漂白が増える可能性があります。録画の露出時間によって、ビデオ録画のフレームレートが決まります。フレームレートを高くすると、信号強度が低下します。フレームレートは、イメージングに使用されるGECIに合わせて最適化する必要があります。
- 顕微鏡を脳定位固定装置に保持するには、顕微鏡グリッパー付きの脳定位固定ロッドを脳定位マニピュレーターに取り付けます.
注:グリッパーは、脳の脳の位置に顕微鏡本体を配置するために、脳定位固定装置に取り付けることができる小さなアクセサリーです。 - 顕微鏡グリッパーで顕微鏡をつかみます。顕微鏡に接続されたLEDライトをオンにし、顕微鏡を垂直に合わせます。画像を観察しながら顕微鏡を下げ、埋め込みたGRINレンズの表面が現れるまで画像を観察します。
- 埋め込まれたGRINレンズの中心をビューの中心に合わせます.
注:GRINレンズの埋め込みの検証は、この手順で実行できます(結果セクションの図2B、図2D、図2Fで説明されています)。 - 埋め込まれたGRINレンズ表面の画像をキャプチャします(キーボードのPrt Scボタンをクリックします)。埋め込まれたGRINレンズ表面の画像は、後のデータ処理中に非ニューロン成分の選択を解除するために必要です(ステップ6.8)。
- 顕微鏡の適切な位置を見つけます。画像を観察しながら顕微鏡の対物レンズをゆっくりと持ち上げて、GCaMP7b発現の細胞を検索します.
注:画像取得のゲインまたは露出LED電力を調整する必要がある場合があります。GRINレンズの埋め込みの検証は、このステップで行うことができます(結果セクションの図2A、図2C、図2Eに記載されています)。
