走査型電子顕微鏡によるマウス脳脈絡叢の可視化

要約

出典: Van Wonterghem, E., et al.マウス脈絡叢の顕微解剖およびホールマウント走査型電子顕微鏡の可視化。J. Vis. Exp.(2022年度)

このビデオでは、走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、マウスの脳から脈絡叢組織を調製し、イメージングする方法を示します。このプロセスには、組織の固定、脱水、および導電性白金層によるコーティングが含まれ、サンプルを安定化してイメージング用に準備します。SEMは、微絨毛で上皮細胞の詳細な画像をキャプチャし、組織の構造的特徴に関する洞察を提供します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.走査型電子顕微鏡(SEM)を使用した脈絡叢(CP)組織の形態学的解析

注意:次の処理ステップでは、有毒溶液が使用されます。サンプル調製はヒュームフードで行うことをお勧めします。

1. 以下に説明するようにSEMのサンプル調製を行います。
   1. 新たに単離したCPを、0.1 M Na-カコジル酸緩衝液(pH 7.4)に2%パラホルムアルデヒドと2.5%グルタルアルデヒドを含有する新たに調製した固定溶液に移します。4°Cで一晩インキュベートします
      注:CP組織は非常に壊れやすく薄いため、組織を小さな標本バスケット(材料表を参照)に入れてバッファー間で移す必要があります。このようにして、組織の構造がよりよく保存されます。カコジル酸ベースの固定液は、強力なカコジル酸緩衝液がEM固定液中のグルタルアルデヒドの低pHに対抗できるため、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ベースの固定液よりも使用されます。
   2. サンプルを3〜5 mLの0.1 M Na-カコジル酸緩衝液(pH 7.4)でそれぞれ5分間3回洗浄します。
   3. 0.1 M Na-カコジル酸緩衝液中の 2% 四酸化オスミウム 3-5 mL にサンプルを 3-5 mL で 3-5 mL 後から 30 分間入れ、サンプルを 3-5 mL の超純水でそれぞれ 5 分間洗浄します。
   4. エタノール(EtOH)濃度を増加させる一連の氷冷溶液(50%、70%、85%、100%)でサンプルを脱水し、EtOH溶液あたり15分間脱水します。臨界点乾燥機を使用して、サンプルを適切にポイント乾燥します。注:液相から気相への変化は表面張力に影響を与え、表面構造に損傷を与えます。臨界点乾燥ステップにより、表面構造の保存が可能になります。
   5. カーボンステッカーが貼られた試料マウントに試料を慎重に置きます(材料の表を参照)。
   6. サンプルを白金の薄層(2〜5 nm)でコーティングします。これを行うには、2つの大電流電気端子の間の真空システムに白金源を取り付け、白金を蒸発温度まで加熱します。白金の細い流れがサンプルに堆積します。手記：プラチナの他に、金または金/パラジウムも使用できます。
2. SEMでCPサンプルを可視化します(材料表を参照)。SEMによるCP組織の可視化手順は、他のタイプの組織と同様に、使用するソフトウェアや機器によって異なります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Aluminium specimen mounts	EM Sciences	75220
Cacodylate buffer	EM Sciences	11652
Carbon adhesive tabs -12 mm	EM Sciences	77825-12
臨界点乾燥機	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	Zeiss		SEMシステム
Forceps	Fine Science Tools GmbH	91197-00
グルタルアルデヒド	EM Sciences	16220
四酸化オスミウム	EM Sciences	19170
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6148
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	ロンザ	BE17-516F
プラチナ	クォーラム	Q150T ES	PBS Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ or phenol red; 滅菌ろ過
試料バスケット ステンレス鋼	EM Sciences	70190-01