筋萎縮性側索硬化症のIn Vitroモデルにおけるシナプスカルシウムダイナミクスの蛍光イメージング

要約

出典:Krishnamurthy, K. et al. 筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定。J. Vis. Exp. (2021)

このビデオは、遺伝的にコードされたカルシウムバイオセンサーを発現するALS変異ニューロンのシナプス活動を監視するためのリアルタイムカルシウムイメージングを示しています。本稿では、イメージングのためのニューロンの準備、カルシウムダイナミクスの刺激、およびニューロンのシナプス活動を反映する細胞内カルシウムレベルのリアルタイムの変化を測定するための蛍光記録の手順を概説しています。

プロトコル

1. Gcamp6mカルシウムトランジェント

1. トランスフェクト一次げっ歯類皮質ニューロンの蛍光イメージングは、500 ngのGcamp6m.
   注:必要に応じて、赤色または遠赤色の範囲の蛍光タグを含む目的のプラスミドを持つニューロンを共トランスフェクションします。
2. 低塩化カリウム(KCl)人工脳脊髄液(aCSF)(表1)とニューロンをトランスフェクション後15分間、トランスフェクション後48時間インキュベートし、その後、ディッシュをイメージングプラットホームにマウントします。
3. フルオレセインイソチオシアネート(FITC)フィルター(488 nm)と20倍または40倍の対物レンズを使用して、GCaMP6m蛍光を可視化します。
4. イメージングフィールドを選択し、パーフェクトフォーカスを合わせます。次に、明視野、FITC、および蛍光マーカーチャネルを使用して、ニューロンの境界をマークする単一の静止画像を撮影します。
5. 集録ソフトウェアで「今すぐ実行」を開始します。ベースライン記録を5分間実行し、その後、50 mM KCL(表1)を含むaCSFで灌流します。
   注:このイメージングの目標は、誘発されたカルシウム過渡現象を測定することです。ニューロンが刺激前の期間中に基礎発火活動とカルシウムフラックスを持っている場合、そのニューロンはデータ解析に使用されません。代わりに、安定したバックグラウンド蛍光を持つ細胞のみが使用されます。カルシウム過渡現象の場合、刺激後の期間を60分まで延長することもできますが、追加の連続的な高KCl灌流の有無にかかわらず可能です。
6. 実験を保存し、共焦点ソフトウェアを使用してデータを解析します。実験はこの時点で停止することができ、分析は後で行うことができます.
   注:細胞が目的のタンパク質の発現のためにトランスフェクションを必要としない場合、このプロトコルは、カルシウム過渡現象を調べるためにin vitroの任意の時点で行うことができます。カルシウム過渡現象の測定を確認するための対照細胞の試験に続いて、実験者は、バイアスを最小限に抑えるために、試験された各皿の遺伝的または薬理学的条件を知らされるべきです。

2.画像解析

1. 共焦点ソフトウェアでタイムラプス画像を開きます。
2. タイムラプスシリーズの画像をコマンドシリーズで整列させる:Image |プロセッシング |現在のドキュメントを整列します。[最初のフレームに揃える] を選択します。
3. 画像フレームの右側にある豆の形をしたアイコンであるROI選択ツールを使用して、神経突起に沿った関心領域(ROI)を選択します。また、背景の蛍光強度を表すROIをマークします.
   注:ROIは、明視野静止画像で示されるニューロンの軌跡に沿って明確に分離された点の領域を選択することによって選択されます。ニューロンごとに少なくとも 5 つの ROI が分析のために選択されます。バックグラウンドROIは、神経突起を含まない視野の領域で選択されます。
4. 次のコマンドシリーズを使用して、選択したROIの生の蛍光を経時的に測定します。 時間測定。
   1. Time Measurementパネルの上部でMeasure機能を開始してください。経時的な生の蛍光のグラフ表現と定量的データの両方が生成されます.
      注:各データポイントは、その特定の測定された時点に関連付けられたフレームのROIの生の蛍光を表します。
5. 生の蛍光強度をスプレッドシートソフトウェアにエクスポートします。

表1:人工脳脊髄液(aCSF)バッファーの組成。

低KCL aCSFバッファー (pH 7.40 to 7.45)
試薬	濃度
HEPES	10 mM
NaCl	140 mM
KCl	5 mM
グルコース	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM
高 KCL aCSF バッファー (pH 7.40 から 7.45)
試薬	濃度
HEPES	10 mM
NaCl	95 mM
KCl	50 mM
グルコース	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM

材料