マウスモデルにおける神経活動と接続性を研究するための2光子ホログラフィック顕微鏡法

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.ヘッドプレートの埋め込み(図1A)

1. 麻酔薬(74 mg / kgケタミンと10 mg / kgキシラジンの混合物)を腹腔内に投与してマウスを麻酔します。ペダル反射を評価して、マウスの麻酔状態を頻繁にチェックしてください。
2. 麻酔後、マウスを定位固定装置に入れます。ヘッドプレートを埋め込むときに角膜が乾燥するのを防ぐために、目の軟膏(材料の表を参照)を塗布します。.
3. 手術部位を剃り、ポビドンヨードまたはクロルヘキシジンスクラブを3回交互に繰り返し、続いて70%アルコールワイプで皮膚を消毒します。頭蓋骨を慎重に露出させ、綿棒できれいにします.
   注:すべての手術器具は滅菌する必要があり、それに応じてすべての手順を実行する必要があります。残っている破片(髪の毛や乾燥した血液など)は炎症反応を引き起こします。したがって、破片は、滅菌水または70%アルコールで湿らせた綿棒を使用して、ステレオスコープで取り除く必要があります。
4. 定位座標(前部と後部= 0.5 mm、内側と外側= bregmaから1.5 mm)を使用して、開頭術の中心を見つけ、マーカーペンでラベルを付けます。
5. カスタムメイドのヘッドプレートを頭蓋骨の中央に置きます。次に、歯科用セメント(材料の表を参照)を塗布して、頭蓋骨にしっかりと固定します。ヘッドプレートが頭蓋骨の前面と背面にしっかりと接触するまで軽い圧力をかけます.
   注:この手順は完了するまでに約20分かかり、2光子イメージング中の脳内の運動アーチファクトを減らすために重要です。ヘッドプレートの寸法は20mm×40mm×1mmで、ホームプレート形状の開口部があり、1つのエッジの長さは15mm、隣接する2つの辺の長さは3mm、残りの2辺の長さは10mmです。
6. アクリルベースの歯科用接着剤樹脂セメントを次のように混ぜ合わせます:粉末の半分、液体の3滴、および触媒の1滴(材料の表を参照)。乾燥を防ぐため、この混合歯科用接着樹脂セメントをマウスの頭蓋骨表面にヘッドプレートで塗布します。
7. 麻酔から回復するまで、マウスを温かいケージに入れます。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。

2.手術とアデノ随伴ウイルス(AAV)注射(図1B)

1. ヘッドプレート移植の1日後に頭蓋骨から歯科用接着剤樹脂セメントを除去せずに開頭術またはウイルス注射を行います.
   注:この手順では、マウスに腹腔内麻酔(74 mg / kgケタミンと10 mg / kgキシラジンの混合物)を投与します。
2. 脳浮腫を避けるために、手術の1時間前にデキサメタゾンリン酸ナトリウム(1.32 mg / kg)を腹腔内に投与します。.
3. ヘッドプレートでマウスに1%イソフルラン麻酔を施し、温熱パッドで体温を保ちながら、気化器(麻酔送達システム)を用いてマウスに麻酔をかけます。角膜の乾燥を防ぐために目の軟膏を塗ってください。
4. ステレオスコープの下で、歯科用ドリルを使用して直径約2mmの円形開頭術を行います。脳の損傷を減らすには、デンタルドリルを一定のわずかな動きと軽い下向きの圧力で慎重に操作します。
5. 吸引システムを使用して骨片を数回取り除きます。骨片を取り除いた後、人工脊髄液(ACSF)溶液を使用して、脳表面に残っている破片を取り除き、洗浄します。
   注:ACSF溶液(140 mM塩化ナトリウム、NaCl、2.5 mM塩化カリウム、KCl、5 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸、HEPES、2.0 mM塩化カルシウム、CaCl₂、および1.0 mM塩化マグネシウム、MgCl₂)を、試薬を溶解してろ過した後、4°Cで1か月間保存しました(細孔サイズ= 0.22μm)。
6. 圧力注入システム(材料の表を参照)を使用して、適切な圧力(パルスで約10ポンド/平方インチ(PSI)を4ミリ秒のパルスで)設定し、先端径10〜20μmのガラスキャピラリー(マイクロピペットプーラーで調製)に500nLのAAV溶液を10分間注入します。
7. ガラス毛細血管内のAAV溶液のレベルが徐々に減少しているかどうかを確認することで、AAV溶液が脳に投与されているかどうかを判断します。
8. 逆流を防ぐために、ガラスキャピラリーをさらに10分間そのままにしておきます。これを3回繰り返して、合計1.5μLのAAV溶液を脳に投与します。
9. 層 2/3 (L2/3) 錐体細胞の神経活動を評価および操作するには、AAV 溶液を注入します (Ca²⁺ イメージングの場合: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE at 1.28 ×^{10 14} vector genomes/mL, diluted 1:1:1 in saline ; Ca²⁺ imaging with optogenetics: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE at 1.73 × 10¹⁴野生型マウスの一次体性感覚皮質の後肢領域にベクターゲノム/mL、生理食塩水で1:1に希釈)を野生型マウス(S1、ブレグマから後方0.5mm、横方向1.5mm、表面から150μmの深さを中心とする)の後肢領域に注入します。
   注:AAV溶液は、jGCaMP8fおよびGCaMP6m-P2A-ChRmine発現のためのイメージングの2〜3週間前および1〜2週間前に注入する必要があります。 それぞれ。
10. マイクロピペットを使用してS1の脳表面に2%(w / v)低融点アガロースを適用した後、2つのカバーガラスで開頭術の上にガラス窓を置きます。2枚のカバーガラス(直径2.0mmの小と直径4.5mmの大きいガラス、材料表参照)を紫外線(UV)硬化型接着剤で貼り付けます。
11. アガロースがまだ液体の状態でカバーガラスをアガロースに押し付けます。これにより、アガロース内に気泡が形成されるのを防ぎます。頭蓋窓の端を歯科用および接着剤の樹脂セメントでシールします(図1C)。
12. マウスを脳定位固定装置から取り外し、ケージに戻します。マウスを温かいケージに入れ、麻酔から完全に回復するまで他の動物と一緒にケージに戻らないでください。サバイバル手術中は、無菌状態を慎重に維持してください。
13. 手術後最初の72時間は、一般的な行動を観察してマウスの健康状態を確認します。一般的な行動に異常がある場合は、抗炎症剤や鎮痛剤を皮下注射します。

3. ホログラフィック刺激または照明システムの準備(図2)

1. 赤色蛍光スライド(キャストアクリル基板)の表面をサンプル平面に配置して、ホログラフィック刺激システムを校正します。顕微鏡を弱い励起光でライブイメージングモードにし、calibration_GUI.mファイルを実行します。パラメータペインを確認し、[保存]ボタンをクリックします。
2. ステップ1ペインの[Zスキャン]ボタンをクリックします。21の軸面すべてに、各平面から2μm離れた3つのランダムスポットを自動的に生成します。
3. スライドバーを動かして、ライブ画像を確認します。スポットが最も小さく、最も明るく見える完璧な平面を見つけて、[保存]ボタンをクリックします。これにより、デジタルホログラムのオフセット球面波面が自動的に生成されます.
   注:最も明るい蛍光スポットが見つからない場合は、スキャン範囲の最小値と最大値を変更して、再試行してください。
4. ステップ 2 ペインの [実行] ボタンをクリックし、左側の四角形にある 6 つのスポットをクリックします。ライブ画像を確認します。区別可能な蛍光スポットが6つある場合は、それらのx軸とy軸を編集ボックスに入力し、[保存]ボタンをクリックします。これにより、ホログラフィック刺激とイメージングシステム間のキャリブレーションを調整するためのアフィン変換係数が自動的に生成されます.
   注:軸ペア番号とクリックされたスポット番号は順番に一致する必要があります。確信が持てない場合、または画像にスポットがない場合は、再試行して独自のスポットパターンを生成するか、視野(FOV)の中心付近のより小さな範囲を選択してください。
5. ステップ3ペインの[スキャン]ボタンをクリックします。441個のデジタルホログラムを生成し、FOV全体で21ステップ×21ステップでシングルスポットスキャンを実行します。
   1. まず、リストボックス内のパターンを変更しながら画像を確認してください>。次に、レーザー出力を調整して、イメージングデバイスのダイナミックレンジ内でスポット画像を取得します(たとえば、画像が過度に飽和しないようにするため)。
   2. その後、エディットボックスでインターバル時間を調整します。インターバル時間は、録画インターバル時間の 2 倍以上にする必要があります。最後に、イメージングデバイスを録画モードにして、[再生]ボタンをクリックします。プレイが完了すると、コマンド ウィンドウに "display OK" 文字列が表示されます。記録を停止し、最大強度法を使用して記録された連続画像を積み重ねます。
6. ステップ 4 ウィンドウで [WM の生成] をクリックし、上から重ねた画像を選択します。次に、calibration_GUIウィンドウを閉じます。各スポットの不均衡な強度を補正するためのウェイトマップが自動的に生成されます
   注:より詳細な説明については、MATLABコードをここからダウンロードできます(https://github.com/ZenKG/SLM_control)。

4. ホログラフィック照明付きイメージセンサーを使用したCa²⁺イメージング(図3)

1. AAVを注入したマウスをヘッドプレート付き顕微鏡下に置きます(図1D).
   注:この手順中、マウスは覚醒状態で拘束されますが、不快な刺激から逃れることができます。
2. ホログラフィック顕微鏡と、25倍の対物レンズで920nmに調整されたモードロックTi:サファイアレーザーを使用して、2光子イメージング(ポイントスキャンモード)を実行します(材料の表を参照)。
3. 市販のイメージングソフトウェアの電源を入れます(資料の表を参照)。ライブイメージングモードでは、画像検出器の電圧(材料の表を参照)とイメージングレーザーの出力を調整して、jGCaMP8fを発現するニューロンの明るさを最適化します。このタンパク質を発現するニューロンの画像をキャプチャします.
   注:イメージングレーザー(920nm)の強度は20〜30mWです。FOVは×皮質表面から100〜150μmの深さで512μm512μmでした。
4. ホログラフィック照明で jGCaMP8f を発現する特定のニューロンを照らすには、SLMcontrol.m スクリプト ファイルを実行します。参照画像をクリックし、上記で取得した画像を選択します。次に、[Spot]ボタンをクリックして、マウスを連続してクリックして画像内のニューロン上の特定のピクセルを選択します(図3A)。選択が完了したら、キーボードのEnterボタンを押して確定します。
   注:デジタルホログラムは自動的に計算され、空間光変調器(SLM)に表示されます。このパターンは、リストボックスをクリックして再表示することもできます。SLMによって生成された単一スポットの空間分解能は、横方向で約1.2μm、光軸に沿って~8.3μmでした。高開口数(1.1)の対物レンズを使用して、より局所的なホログラフィック刺激を実現しました。
5. イメージセンサーを使用して高い時間分解能で神経活動を検出するには(資料の表を参照)、画像取得(図3C)を実行する前に、露光時間、イメージングエリア、およびビニング(図3B)を設定します。
   注:1つのニューロンを連続的に刺激するホログラフィック照明レーザー(920nm)の強度は2mWで、神経活動を検出するのに十分です。例えば、イメージングのフレームレートを100Hzにするには、露光時間を9ms、撮像エリアを400μm×400μm、ビニングを4とします。
6. 実験後、マウスをホームケージに戻します。

5. ホログラフィック顕微鏡を用いたオプトジェネティクスによる二光子イメージング(ポイントスキャンモード)(図4)

1. 手順4.1と4.2を繰り返します。
2. 市販のイメージングソフトウェアの電源を入れます(資料の表を参照)。ライブイメージングモードでは、画像検出器の電圧(材料の表を参照)とイメージングレーザーの出力を調整して、GCaMP6m-P2A-ChRmineを発現するニューロンの明るさを最適化します。これらのタンパク質を発現するニューロンの画像をキャプチャします(図1E)。
3. 手順4.4を繰り返します。
4. L2/3ニューロン内の機能的結合性を調べるには、SLMを使用して光遺伝学的刺激のホログラフィックパターンを生成し(ChRmine;1,040 nm)、それを2光子Ca²⁺イメージング(GCaMP6m;920 nm、512 × 512ピクセル、2 Hzまたは30 Hz、2倍デジタルズーム、ポイントスキャンモード;図3D-H)。
   1. このプロトコルでは、イメージングレーザーの強度を10-20 mWの920 nmに設定し、FOVを皮質表面から100-150 μmの深さで測定した256 μm×256 μmに設定します。ピクセル滞留時間を 2 Hz の場合は 1.5 μs、30 Hz の場合は 100 ns に設定します。
   2. 1 つのホログラフィック刺激がニューロンのカルシウム応答を引き起こしたかどうかを確認するには、イメージング フレーム レートとして 2 Hz と 30 Hz の両方を使用します。神経活動を誘発するのに十分な10mWで単一のニューロンを刺激するホログラフィック刺激レーザー(1,040nm)の強度を設定します(図3D).
      注:SLMによって生成された単一のスポットの空間分解能は、横方向に沿って約1.2μm、光軸に沿って~8.3μmです。左右方向のアクセス可能な体積範囲は、軸方向に約500μm、500μm×100μmです。さらに、2Hzまたは30HzのイメージングフレームレートでのCa²⁺イメージングにより、1つのニューロンだけでなく、複数のニューロンを同時にホログラフィックに刺激できることを確認しました(図3E)。
5. 次のプロトコルで画像取得を実行します: 10 秒間隔 (0.125 Hz) の 1,040 nm で 10 のホログラフィック刺激を使用して、920 nm の Ca²⁺ 応答を 8 秒間隔 (0.125 Hz) のベースライン期間の 50 ミリ秒後に同時に画像化します。

図1:実験手順の概略図。(A)頭蓋骨へのヘッドプレートの固定。(B)一次体性感覚皮質 (S1HL) の後肢領域への AAV の定位注射。(C)頭蓋窓の移植。神経活動を評価および操作するために、覚醒マウス(D)でホログラフィック刺激(E)を用いて、in vivo Ca2+イメージングを行います。フラッシュマークは、ホログラフィック刺激または照明を示します。

図2:ホログラフィック刺激または照明システムのキャリブレーション方法のフローチャート。このフローチャートでは、ホログラフィック刺激または照明システムをサンプル空間およびイメージング システムに対してキャリブレーションする手順について説明します。詳細な手順については、ステップ3のホログラフィック刺激または照明システムの準備にアクセスし、サンプルプログラムをダウンロードしてください。

図3:ホログラフィック顕微鏡を使用したイメージングと機能的接続の代表的な結果。(A) jGCaMP8fまたはGCaMP6m-P2A-ChRmineを発現する特定のニューロンを照らすために、ニューロンの画像を取得し、カスタムメイドのMATLABスクリプトを使用してニューロン上にスポットを形成します。(B)イメージセンサーの設定(露光時間、撮像範囲、ビニング)。(C)ホログラフィック照明とイメージセンサを用いた100HzイメージングにおけるjGCaMP8fを発現する神経細胞の代表像と微量。(D)このグラフは、各レーザー出力(GCaMP6m-P2A-ChRmineのデータ)でのホログラフィック刺激(1,040 nm)に対する神経応答を示しています(GCaMP6m-P2A-ChRmineのデータで、2Hzのイメージングフレームレート[n = 16])。エラーバーは、平均の標準誤差を示します。(E)2 Hz(左)および30 Hz(右)のイメージングフレームレートでの10の異なるニューロンのホログラフィック刺激(青い垂直線)中の代表的なCa2+トレース。2 Hz と 30 Hz の Ca2+ トレースでは、同じ色が同じニューロンを示します。(F)ニューロン間の機能的接続を評価する模式図。オレンジ色のニューロンが刺激されると、赤色のニューロンも同時に反応し、これらのニューロン間に機能的な接続性があることを示しています。(G)野生型(WT)でGCaMP6mを発現するS1HLニューロンの典型的な画像。スケールバー = 10 μm. (H) 2 Hz (上) および 30 Hz (下) のイメージング フレーム レートでのホログラフィック刺激 (青い縦線) 中の典型的な Ca2+ トレース。刺激されたニューロンはオレンジ色で、応答するニューロンは赤で、応答しないニューロンは灰色で囲まれています。ホログラフィック刺激に対する神経応答性は、2 Hz と 30 Hz の両方のイメージング速度で検出できます。

図4:ホログラフィック顕微鏡に使用されたシステム。(A)顕微鏡(中央)付近のホログラフィック刺激および照明光路(左)とイメージセンサー(右)の画像。(B)これらは、それぞれのSLMの周りのホログラフィック刺激と照明の光路(左と右)とスキャンヘッドの周りの点走査光路(中央と右)の拡大画像です。(C)刺激およびイメージング光路の概略図。位相のみのSLMを使用してデジタルホログラムを表示し、ビームエキスパンダー(L1とL2の組み合わせ)と4fリレーシステム(ホログラフィック刺激用のL3とL4の組み合わせ、ホログラフィック照明用のL4とL5の組み合わせ)をそれぞれのSLMの前後に配置して、各デジタルホログラムが水浸対物レンズの射出瞳に撮像されるようにします。 画像サイズがわずかに不足しています。残留ゼロ次成分を抑制するために、ビーム ブロックが中間平面に配置されます。