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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. タイムラプスイメージングのための顕微鏡のセットアップ
1. レーザー設定の決定
1.使用するレーザー波長の決定。目的の蛍光色素の励起波長の2倍の波長を使用します(例:緑色蛍光タンパク質(GFP)の場合は880〜940 nmの波長)
注:本研究では、GFPの波長設定は880〜940 nmでした。波長が高ければ高いほど、レーザーの出力は低くなります。
2. レーザー透過率を決定します。レーザー透過率が高いと胚が死滅し、最低レベルの透過率を使用します(推奨)。24〜48時間のタイムラプス研究では、本明細書に示されているように、透過率を5%未満に保ちます。
3. 顕微鏡検出システムを決定し、蛍光色素に適したフィルターが所定の位置にあることを確認してください。
注：多光子顕微鏡では、放出された蛍光に対してさまざまな感度を持つ複数の検出システムがあります。一般に、内部検出システムは外部検出システムよりも感度が低くなります。GFP発現量が高いトランスジェニック株には、内部検出システムが適切です。GFP発現のレベルが低いトランスジェニック株や他の蛍光色素(赤色蛍光タンパク質など)を含むトランスジェニック株の場合、レーザー透過率を妥当なレベルに維持するために、外部検出システムが必要になる場合があります。使用する検出システムに関係なく、蛍光色素に適したフィルターを装着する必要があります。
2. 多光子顕微鏡でのソフトウェア設定の調整
1.5X対物レンズを使用して、胚を見つけます。ステージを手動で最も高い位置に上げ、ファインフォーカスを使用して胚を顕微鏡範囲の中央に配置します。
2. 手動でステージを下げ、5倍対物レンズを25倍水浸対物レンズに変更します（開口数NA、0.95）。胚の焦点を戻すために、ステージを慎重に上げます。
3. ソフトウェアで、"xyzt"モードをクリックして、"z"の深さにわたってx-y平面の時間間隔(t)で複数の画像を取得してください。落射蛍光または明視野ビューを使用して、Zスタックを区切る対象領域の焦点深度を見つけます。
1. ソフトウェアで「開始」ボタンをクリックしてください。これらの実験では、目の横方向の端がZスタックの始まりでした。「終了」ボタンをクリックします。胚の正中線はZスタックの終わりでした
注:ステップサイズは0.3〜0.6μmで、zスタックサイズが60〜120μmの場合、合計~200ステップありました)。
4. 取得時間とイメージング頻度を調整するためのメニューをクリックしてください。
現在のシステムでは、~200ステップで各Zスタック取得に約5分かかります。蛍光色素の適切な回収と胚の生存のためには、zスタック取得(レーザーパワーオン)と回復時間(レーザーパワーオフ)の間に少なくとも1:3の比率を考慮してください。
注:たとえば、zスタックは20分ごとに取得され、5分間のzスタック取得と15分間の回復が行われます。このプロトコルでは、より大きなzスタックを取得できますが、zスタックの取得間隔が適切に長くなり、タイムラプスコースでの画像が少なくなります。
1. 胚の回復に適切な時間で、指定されたウィンドウでzスタック間の時間を設定します。適切なウィンドウで実験の合計時間を設定します。
5. 最終的なソフトウェア、レーザー、および胚の調整を行います。
1. ライブ画像の設定をオンにして、レーザー設定の最終調整を行います。ソフトウェア内でレーザー透過率、ゲイン、オフセットスライダーバーを調整して、蛍光画像を最適化します。また、必要に応じて、実験の長さ、胚の予想される成長などに応じて、胚の向きを調整します。実験の期間中、対象領域がフレーム内に留まることを確認します。
2. 脱落蛍光光源は、タイムラプス取得中に不要になったため、オフにしてください。ステージをレーザーセーフティボックスで覆います(図1I)。内部検出システムを使用する場合、レーザーセーフティボックスは背景光から保護するのに十分です。
注:ただし、より感度の高い外部検出システムでは、レーザーセーフティボックスが十分な背景光を遮断しないため、画像取得の中断を防ぐために追加のカバーが必要になります。
2. タイムラプス撮影中
1.レーザーセーフティボックスのスライドドアからのタイムラプス取得中に、8〜12時間ごとに(1日あたり少なくとも2回)オープンバスチャンバーにタイムラプス胚培地を補充します(図1I)。
2. レーザーセーフティボックスのドアを開ける前に、顕微鏡が積極的に画像を取得していないことを確認してください。
注：24時間から48時間のタイムラプスイメージング実験には、ヒーターや循環メディアシステムを使用する必要はありません。実際、ステージヒーターとインラインヒーターの両方の温度を制御することは困難であり、画像取得中、胚は25〜28°Cの温度範囲で適切な発達速度を示します。さらに、循環メディアシステムはオーバーフローし、機器に損傷を与える可能性があります。したがって、すべての胚は取得後に定期的にステージングされます。
3. 取得後の処理
1.ソフトウェアで、「ファイル」メニューをクリックし、「保存」を選択します。
2. 画像処理ソフトウェアでファイルを開きます（資料表を参照）。正しい画像シリーズを強調表示します。ソフトウェアで、「プロセス」メニューを選択します。3Dデコンボリューションをクリックし、「適用」をクリックして各z-stackをデコンボリューションします.
注:ファイルが大きいです。したがって、この手順には数時間かかる場合があります。
3. ソフトウェアの「プロセス」メニューの下で、「最大投影」をクリックしてください。「適用」をクリックすると、最大投影が開始され、zスタックごとに1つの画像が生成されます。最大投影された各ファイル(zスタックごとに1つの画像)をtiffとしてエクスポートします。
4. 個々のtiffファイルをビデオ処理ソフトウェアにインポートします。すべてのtiffファイルを選択し、ビデオエディタにドラッグします。ビデオ内の各画像の長さを 0.1 秒に調整します。ビデオをmovまたはmp4ファイルとしてエクスポートします。
