ショウジョウバエにおける胚性運動ニューロンの軸索投影パターンの可視化

1.調製

1. 0.5 gのウシ血清アルブミン(BSA)と0.5 mLのt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(PBT)溶液を含む500 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製し、1X PBSの500 mLに0.5 mLのt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(材料の表を参照)を加え、少なくとも30分間攪拌します。
2. 2.5 mLの16%ストックパラホルムアルデヒド溶液と1 mLの10x PBSを6.5 mLの脱イオン水に加えて、10 mLの4%パラホルムアルデヒドを10 mL調製します。4°Cで保存し、1週間以内に使用してください
   注意:パラホルムアルデヒド溶液は非常に有毒であるため、皮膚との接触を避けてください。
3. DMSO1 mLあたり0.1 gのX-Gal基質を溶解することにより、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-Gal)基質(10% w/v X-Gal in dimethyl sulfoxide（DMSO〉)を作製します。-20°Cで100μLのアリコートで保存してください。
4. 10 mMリン酸緩衝液(pH 7.2)、150 mM塩化ナトリウム、NaCl、1 mM塩化マグネシウム、MgCl₂、3 mMフェロシアン化カリウム、K₄[FeII(CN)₆]、3 mMフェリシアン化カリウム、K₃[FeIII(CN)₆]、および0.3% t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを使用してX-Gal染色溶液を作製します。暗所で4°Cで保管してください。
5. 30%ストック過酸化水素を脱イオン水で1:10に希釈することにより、3%過酸化水素溶液を作ります。
6. 1錠(10 mg)のDABを35 mLの新鮮なPBT溶液に完全に溶解することにより、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液を調製します。0.2μmシリンジフィルターでろ過し、-20°Cで910μLアリコートで保存します.
   注意:すべてのDAB廃棄物を漂白剤に廃棄してDABを破壊します。
7. りんごジュースでエッグプレートを作ります。2Lのフラスコに35gの寒天と1Lの脱イオン水を加えます。1-Lフラスコにショ糖33g、テゴセプト2g、リンゴジュース375mLを加えます。オートクレーブで30分間溶かします。両方の溶液を約60°Cまで冷まし、これらの溶液を攪拌してよく混ぜ合わせます。60 mm培養皿あたり~11 mLの混合溶液を注ぎます。
8. パン酵母を脱イオン水(1:0.8の比率)にブレンドしてイーストペーストを作り、4°Cで保存します。

2.胚採取(1日目)

1. 雌と雄のハエ(5日未満)を採取し、1〜2日間、中央に少量の酵母ペーストが入った卵板(60mm×15mm)を載せたプラスチック製のビーカーケージに飼育します。
2. 後期16個の胚を最適に採取するには、午後5時頃にハエ(>50匹)の入ったボトルケージを設置し、25°Cで3時間産卵させます。
3. ハエを生鮮食品のボトルに移します。
4. エッグプレートを蓋で閉じ、加湿インキュベーター(湿度~70%)で25°Cで逆さまにして一晩インキュベートします。

3.免疫染色のための胚の準備(2日目)

1. 午前10時20分頃にPBT溶液1.8mLを卵プレートに加え、綿棒を使用してプレートを傾けながらプレートから胚を緩めます。
   注:綿棒を使用して酵母ペーストをやさしくつぶすことにより、多数の胚が見つかった場合は溶解します。固定の~40分前(午前11:00頃)から胚の採取を開始します。
2. 1 mLピペットチップを使用して、卵プレートから1.5 mLマイクロチューブに胚を移します。
3. 胚が落ち着くのを待ち、PBT溶液をできるだけ吸引します。胚を1mLのPBT溶液で2回すすぎます。PBT溶液はできるだけ吸引してください。
4. チューブに1mLの50%漂白剤(すなわち、脱イオン水で希釈)を満たし、室温(RT)で3分間ニューテーター上で胚をインキュベートすることにより胚をデコレーションします
   注:このステップはデコレーションされた胚を殺しません。
5. デコレーションされた胚が落ち着くのを待ち、50%漂白剤をできるだけ吸引し、1mLのPBT溶液で胚を3回すすぎます。
6. 0.5 mLのヘプタンを加え、続いて0.5 mLの4%パラホルムアルデヒド溶液をRTで午前11:00頃にチューブに加えます。
7. 胚をニューテーターでRTで15分間インキュベートします。
8. 4%パラホルムアルデヒド溶液(最下層)を取り除きます。
9. 0.5mLの100%メタノールを加え、チューブを30秒間激しく振とうして胚を脱ビテリン化します。
10. ヘプタン(つまり、最上層)を削除します。
11. 0.5 mLの100%メタノールを加え、チューブを10秒間激しく振とうします。
12. チューブを軽くたたいて胚が落ち着くのを待ち、メタノールをできるだけ吸引します。100%メタノールの1mLで胚をすすぎ、10 s.
    注:メタノールへの長時間の曝露はβ-Gal活性を破壊します。
13. メタノールを除去し、脱ビテリン化した胚を1mLのPBT溶液で3回すすぎます。

4. LacZ染色による胚のジェノタイピング(2日目)

1. 1 mLのPBT溶液をチューブに加え、チューブを37°Cのヒートブロックまたはウォーターバスで15分間インキュベー
トします。
2. インキュベーション中に、X-Gal染色溶液(チューブあたり1 mL)を65°Cの水浴に曇るまで置きます。37°Cの水浴でインキュベートします。
3. PBT溶液を吸引し、1 mLのX-Gal染色溶液と20 μLのX-Gal基質をチューブに加えます。
4. 青い沈殿物が明らかになるまで、チューブを37°Cでインキュベートします.
   注:2番目と3番目の青いバランサーのインキュベーション時間は、一般的に2〜4時間の範囲です。
5. X-Gal染色液を取り出し、RT PBT溶液1mLで胚を3回すすぎます。
6. 針プローブまたは鉗子を使用して、目的の遺伝子型の胚(すなわち、染色されていない白色胚)を光学解剖顕微鏡(1.6X-2.5X対物レンズ)で手で選別します。
   注:CyO、actin-LacZ、TM3、actin-LacZなどの一部のブルーバランサーは、アクチンの制御下で細菌β-Gal(LacZ)を発現するトランスジェニックコンストラクトを運ぶためプロモーター、ユビキタスな方法で青色に染色された胚は、ブルーバランサー染色体の1つまたは2つのコピーを含んでいます。したがって、染色されていない白色胚は、所望の致死性対立遺伝子に対してホモ接合体である。

5. 抗ファシクリンII抗体による胚の免疫染色(2-3日目)

1. 目的の遺伝子型の胚(すなわち、染色されていない白色胚)を収集し、1mLピペットチップを使用して0.5mLマイクロチューブに移します。
   注:このステップでは、キューティクルのセグメンテーションパターンや頭と尾の構造など、形態学的基準に従って胚を大まかにステージングできます。頭部退縮中、卵子が産まれてから10〜16時間後に、胚は前部の顕著な減少を受けます。
2. 胚を0.4mLのPBT溶液で一度洗浄し、0.3mLのブロッキング溶液(5%正常ヤギ血清および5%DMSOのPBT溶液)を加えます。
3. RTで15分間ナットで胚をブロックします。
4. 75 μLの抗ファシクリンII抗体を添加し、チューブをRTで一晩ヌケッティングしてインキュベートします。
5. 胚を0.4mLのPBT溶液で4回、1回の洗浄につき少なくとも20分間洗浄します。
6. ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ(抗マウスHRP)抗体(2 μg/mL)を含むブロッキング溶液(PBT溶液中の5%正常ヤギ血清)0.3 mLを加え、チューブを室温でインキュベートしながら一晩インキュベートします。
7. 胚を0.4mLのPBT溶液で6回、1回の洗浄につき少なくとも20分間洗浄します。
8. 0.3mLのDAB溶液をチューブに加えます.
   注意:手袋を着用し、すべてのDAB廃棄物/チューブ/チップを漂白剤に入れます。
9. 2 μLの3%過酸化水素を加え、所望の量の沈殿物が生成されるまで、RTで章動を使用して暗所でチューブをインキュベートします。
   注:1D4免疫組織化学のインキュベーション時間は、一般に0.5〜1時間の範囲です。
10. 胚を0.4mLのPBT溶液で4回洗浄します.
    注意:DAB溶液を取り出し、最初の2回の洗浄をピペットで行い、漂白剤で廃棄します。
11. 0.2 mLのマウンティング70%グリセロール/ PBS溶液をチューブに加え、RTまたは4°C.
    注:チューブを光から遠ざけてください。より透明な調製物は、胚を90%グリセロール/PBS溶液に入れることによって得ることができます。しかし、90%グリセロール/PBS溶液で透明化された胚は、70%グリセロール/PBS溶液で透明化された胚よりも解剖が困難です。

6. 胚のステージング、解剖、マウント、イメージング (4日目)

1. ステージングのために、70% グリセロール/PBS で平衡化した胚をスライドガラスに移します。
2. 腹部セグメント7(A7)、A8、およびA9セグメント間神経(ISN)神経が互いに接触するように収束している、または中腸が3つのバンドに細分されている後期ステージ16の胚を収集します。.
   注:1D4抗体で染色された胚は、ISNおよびISNb運動軸索の投影パターンに基づいて病期分類できます。中枢神経系(CNS)を出た後、後期ステージ16胚のA7、A8、およびA9 ISN神経は、互いに接触するために収束し、その後分岐して背筋まで遠くまで伸びます(図1Aの矢印)。しかし、中期16の胚では、A7 ISN神経はA8/A9神経と並行して伸びています(図1Bの角括弧)。さらに、両半節のA6 ISNb神経(腹外側筋に垂直)の投影軸は、CNS縦軸索束の後端とほぼ整列しています(図1Cの矢印と線)。これらの形態学的基準は、遺伝子型によって異なります。あるいは、腸の形態に基づいて胚を病期分類することもできます。ステージ17より前は、中腸はハートのような形をしていますが、ステージ17では中腸は3つのバンドに細分されます。
3. 胚を解剖します。
   1. 1mLの注射器を使用して、各胚をグリセロール滴から取り出し、胚の腹側を上にして置きます。体長の1/4で前部を切り取り、運動軸索のない最も後部を切り取ります。
   2. ニードルプローブを使用して、エンドカット胚をグリセロール滴から移動させ、背側を上に向けるように転がし、フィールドに水平に置きます.
      注:胚がグリセロール滴から移動されると、胚に関連するグリセロールが少し付着すると粘着性があります。
   3. 1本の非常に細いタングステン針を使用して、背側正中線に沿って胚を切断します。胚の後端に小さな切り込みを入れ、次に背側の正中線を前側に向かって切り続けます。逆方向のカットも問題ありません。
   4. 針プローブを使用して、正中線に切断された胚をグリセロール滴に移動し、背側を上にして置き、各体壁を腹側(対角線)方向に展開して腸を体壁から切り離します(2.5倍対物レンズ).
      注:背側正中線が完全に切断され、左右の体壁が完全に分離されていることを確認してください。
   5. 正中線にカットされた胚をグリセロール滴から慎重に移動させ、細い針プローブ(2.5倍対物レンズ)を使用して、体壁の2つのフラップをスライドガラスに置きます。
   6. 非常に細いタングステン針を使用して、解剖した胚から内臓を横方向に押して除去します(5倍対物レンズ).
      注:別の同様の解剖手順の詳細な説明は、ウェブサイトで見つけることができます。
4. マウントするには、2-3 μLの70%グリセロール/PBS溶液を洗浄して解剖した胚に加え、細い針プローブを使用して、8 μLの70%グリセロール/PBS溶液を中央に広げた新しいスライドガラスに移します(2.5倍対物レンズ)。
5. カバーガラス(18 mm x 18 mm)を貼ります。カバースリップの端を通常のマニキュアで密封します(透明でも色付きでも問題ありません)。
6. 製造元の指示に従って、微分干渉コントラスト(DIC)光学顕微鏡の下で高解像度(20X、40X、および63X油浸対物レンズ)で画像をキャプチャします。
   注:特にISNbモーター軸索の場合、63X油浸対物レンズを使用することで、より優れた視覚化と表現型の特性評価を行うことができます。

図1:ISNおよびISNb運動軸索の投影パターンに基づく胚の病期分類。(A)後期-16の野生型胚では、A7、A8、およびA9 ISN神経(矢印)が収束して互いに接触します(矢印)。前方は左で、腹側は下にあります。スケールバー = 15 μm. (B) 中期の野生型胚では、A7 ISN神経はA8/A9神経と並行して伸びています(角括弧)。矢印はA7、A8、およびA9のISN神経を示しています。前方は左で、腹側は下にあります。スケールバー = 15 μm. (C) FasII抗体で染色した後期ステージ16野生型胚のフィレット調製。左右のA6 ISNb神経の投影軸(矢印)は、CNS縦軸索束(黒線)の後端とほぼ整列しています。腹部セグメントA1-A7は上部にラベルが付けられています。前方が左です。スケールバー = 15 μm.