ゼブラフィッシュ幼生の脳のin vivoイメージングによる小脳ニューロンの可視化

要約

出典:Schramm, P. et al.頭蓋骨および皮膚の除去による覚醒したゼブラフィッシュの幼虫および幼魚の完全活性脳組織のin vivoイメージング。J. Vis. Exp. (2021)

このビデオは、プルキンエ細胞の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ幼生の小脳ニューロンのin vivoイメージングを示しています。このプロセスでは、幼虫に麻酔をかけ、アガロースに固定し、色素沈着した皮膚を慎重に除去して、光の透過性と蛍光強度を高めます。最後に、調製した標本を共焦点顕微鏡で画像化し、標識されたニューロンを鮮明に視覚化します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 幼虫の麻酔と埋込の準備
   1. 実験を開始するときは、プラスチック製のパスツールピペットで必要な動物を直径90mmのシャーレに移し、ダニオー(ダニオーと一緒にシャーレに保管されている幼虫の場合)または魚施設からの水(受精後7日以上経過した幼虫の場合[dpf])のいずれかで満たされています魚の施設で)。
      1. 2週間以上経過した魚をピペッティングする場合は、ピペットの開口部が十分に大きく、移すときに魚を傷つけないようにしてください。ネットは魚、特に若い幼生に物理的に損傷を与えるため、使用しないでください。
   2. ペトリ皿に保管されている幼虫のサイズに適した ワムシ または アルテミア ノープリウスを追加して、餌への自由なアクセスと幼虫の健康状態を最大限に確保し、ストレスを軽減します。
   3. 埋込するには、選択した幼虫を人工脳脊髄液(ACSF)で満たされた直径35mmのシャーレに移します。必要な量のd-ツボクラリンを添加して、使用濃度/有効用量を10μMにし、幼虫が完全に固定されるまで数分間待ちます。
      注:魚が年をとるとき、またはより速い完全麻酔が必要な場合(5分以内)、d-ツボクラリンの濃度を上げることが可能です(マウスのLD50は静脈内投与で0.13mg/kgです)。また、α-ブンガロトキシン(使用濃度:1mg/mL)など、クラーレと同じ効果を持ち、脳を完全に活性化させる別の麻酔薬を使用することも可能です。完全に活動的な脳が関心のある対象に必要ない場合、非致死量(0.02%)のトリカインも幼虫を完全に麻酔するための選択肢です。しかし、トリカインはナトリウムチャネルを遮断し、それによって脳の活動を損ないます。
   4. 直径35mmのシャーレの蓋を取り、蓋を逆さまにして、蓋の底に正方形のガラスカバースリップ(24×24mm)を敷いて取り付けチャンバーを準備します。これらの手順の概略説明については、図 1 (上部) を参照してください。ガラスの表面が滑らかになっているため、頭蓋骨の開封手順中に幼虫が入っているアガロースブロックが滑り落ちるのを防ぎます。
   5. 適切なバイアル(例:.、50 mLチューブ、ビーカー、ショットボトルなど)でその日に必要な量のACSFを分注し、カルボゲン(5%CO₂、95%O₂)で酸素化します。.形態学(蛍光パターンなど)のみをイメージングする場合でも、脳の完全性を確保し、細胞が浸透圧効果によって悪影響を受けないようにするためにACSFが必要ですが、ACSFの酸素化は必要ありません。このステップは、イメージングに全脳活動が必要な場合にのみ実行する必要があります。
      注:培地の最適な酸素飽和度を得るには、カルボゲンチューブの端にエアストーンを追加します。十分に高い酸素レベルを保証するためには、同じイメージングチャンバーに埋め込まれた幼虫の数と年齢に応じて、イメージングチャンバー内のACSFを20〜60分ごとに新たに酸素化されたACSFと交換する必要があります(例えば、1つの埋め込まれた幼虫の場合、1時間ごとにACSFを交換するのに十分です)。14 dpfより古い幼虫を並行して埋め込む場合、20分ごとにACSFを交換する必要があります)ので、計画された実験に従って必要な酸素飽和ACSFの量を計画してください。
2. 幼虫の埋め込み
   1. 完全に麻酔された幼虫をプラスチック製のパスツールピペットで(ステップ1.4で)準備された取り付けチャンバーに移します。次に、低融点(LM)アガロースの希釈を避けるために、余分な培地を慎重に取り除きます。以下のすべての手順は、十分な倍率の実体顕微鏡下で実行する必要があります。
      注: 取り付けチャンバーを傾けると、媒体を完全に取り外すのに役立ちます。
   2. 幼虫の上に十分な大きさのLM-アガロース滴(幼虫のサイズに応じて約1mL)を追加して、動物を乾燥から保護し、不要なストレスを軽減することにより、すぐに次のステップに進みます。
   3. アガロースが固まる前に、幼虫を所定の位置に向けます。幼虫の背側部分が上を向いていることを確認してください。また、幼虫はアガロースの表面にできるだけ近づけて埋め込むようにしてください。
      注: 同時に埋め込む予定の幼虫のサイズと数に応じて、アガロースの濃度を調整することが可能です。たとえば、30 dpf齢の1〜3匹の幼虫の場合、1.8%〜2%のLM-アガロースの濃度が推奨されます。7 dpf齢の1〜4匹の幼虫には、2.5%のLM-アガロースを使用するのが最も実用的ですが、5〜8匹の幼虫には2%がより適しています。完全に活動的な脳が必要な場合は、幼虫の操作に必要な時間を短縮するために、同時に3匹の魚だけを埋め込むことをお勧めします。一般に、幼虫が年をとるほど、または同時により多くの幼虫が埋め込まれる予定であるほど、低濃度(1.8%-2%)を使用することをお勧めします。
   4. 倒立顕微鏡を使用して画像を記録する場合は、幼虫を含むアガロースブロックを小さな直方体の形状にトリミングします。これは、後で幼虫をイメージングチャンバーに移すために重要です。正立顕微鏡を使用する場合、マウントチャンバーをイメージングチャンバーとしても使用できるため、このようなトリミングは必要ありません。図 1 (上部) では、これらの手順の概略的な説明を見つけることができます。
3. 脳の露出
   注: 以下のすべての手順は、幼虫を不必要に傷つけないように細心の注意を払って実行する必要があります。実験に完全に活動的な脳が必要な場合、魚がまだ完全にアガロースに取り付けられ、酸素化されたACSFのない開いた頭蓋骨を持っている間、1秒ごとに脳は酸素不足に苦しみ、乾燥することに注意してください。酸素欠乏の影響は、埋め込まれた幼虫が年をとるほどさらに劇的になります。したがって、針による脳の機械的な損傷を避けるために、可能な限り短い時間内だけでなく、最大限の精度で手術を行うことが重要です。ステップ3.2-3.4は、トレーニング時に魚1匹あたり30秒を超えないようにする必要があります。
4. アガロースが固まったらすぐに手術を開始します。まず、関心のある脳領域の上にある余分なアガロースをすべて切り取り、頭部への自由なアクセスと明確な作業スペースを確保します。頭の背側部分がすでにアガロースから突き出ている場合は、この手順をスキップしてください。
5. 関心のある地域に応じて、手術を開始する場所を選びます。ガラス針を取り、組織に深く浸透しすぎないように、皮膚に小さな切開を行います。これが、オーバーレイされたスキンを剥がすための出発点になります。
   注:最適な結果を得るには、重要な構造物を損傷するリスクを減らすために、関心のある領域の真上から始めないでください。必要に応じて、後脳の後方から始めて、皮膚の不要な領域が剥がれるまで前進することが可能です。
6. 皮膚の部分に沿って非常に小さな切り込みを入れ続け、表面のすぐ下にある針をかろうじて動かして取り除くことを目指しています。ほとんどの場合、脳の周りを完全に動かしたり、円状の皮膚や頭蓋骨を切り取ったりする必要はなく、頭に沿って2つの切開を行い、皮膚を片側または反対側に押し出すだけです。図2は、小脳への自由なアクセスを得るための最適な切断戦略の概略図を示しています。
   注:このマイクロサージェリーはデリケートな手順であり、下にある脳に損傷を与えることなく皮膚を完全に除去するには、おそらくいくつかのトレーニングが必要になります。また、関心のある脳領域に最適な切断戦略を見つけ、実験期間中それを続けることもお勧めします。
7. 埋め込まれたすべての幼虫から皮膚を取り除いた直後に、アガロースに(酸素化された)ACSFを注ぎ、不要な皮膚粒子と血液をあふれさせ、脳を完全に活性化させ、乾燥から保護します。
   注: 実験に健康な脳が必要な場合は、一度に最大3匹の魚を摂取することをお勧めします。
8. 正立顕微鏡を使用する場合は、イメージングから直接開始します。
   1. 倒立顕微鏡を使用する場合は、直方体のアガロースブロックの下に小さなヘラをスライドさせます(ステップ2.4)。
   2. イメージングチャンバーの底部(ガラス底皿など)にLM-アガロースを少量加え、幼虫を含むアガロースブロックをヘラで180°反転させ、液体アガロース液滴が接着剤として機能する間、イメージングチャンバーの底に静かに押し込みます。
   3. アガロースが固まったら、イメージングチャンバーに(酸素化された)ACSFを充填し、イメージングを開始します。概略図の説明については、図 1 (下部) を参照してください。
9. 実験に全脳活動が必要な場合は、イメージングチャンバー内のACSFの酸素レベルが十分に高いことを常に確認してください。これを確実にするために、培地は20〜60分ごとに新たに酸素化されたACSFと慎重に交換する必要があります(魚の数とサイズ、イメージングチャンバーのサイズと表面、およびイメージング時間によって異なります)。

結果

図1:in vivoイメージング用のオープンスカルゼブラフィッシュの作製手順の概略図。さまざまな手順の作業手順は、グラフィック自体に記載されています。グラフィックはフロリアン・ヘッチがデザインし、ポール・シュラムが脚色しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
共焦点レーザー走査型顕微鏡	Leica	TCS SP8
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
ガラスキャピラリータイプ1	WPI	1B150F-4
ガラスキャピラリータイプ2	ハーバード装置	GC100F-10
ガラスカバースリップ	デルタラボ	D102424
イメージングチャンバー	イビディ	81156
LM-アガロース	コンダラブ	8050.55
顕微鏡カメラ	ライカ	DFC9000 GTC
ニードルプラー タイプ1	ナリシゲ	モデル PC-10
ニードルプラー タイプ 2	サッター器具	モデル P-2000
パスツールピペット 3ml	A.ハルテンシュタイン	20170718
トリカイン	Sigma-Aldrich	E10521-50G
35 mm シャー	テット	833900
90 mm シャー	ルシュテット	821473001

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