動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1. 原子間力顕微鏡(AFM)対応インデンテーション
- 直径60mmのペトリ(P60)皿を、製造元の指示に従って淡水産貝由来の生体接着剤で準備します。
- 0.1 M重炭酸ナトリウムからなる中性緩衝液を、最適pH 8.0の滅菌水中に調製します。重曹緩衝液を(0.2ミクロン)フィルター滅菌し、4°Cで保存します。
- 層流フードで、重曹緩衝液に6.25%ムール貝由来の生体接着剤と3.125%水酸化ナトリウム(NaOH)の溶液を混合します。
- 100μlの生体接着溶液を直径60mmのペトリ(P60)ディッシュにピペットで固定し、ピペットチップを使用して溶液を直径3〜5cmの円に広げます。
- P60ディッシュを層流フードに蓋をせずに放置し、溶液を乾燥させます(~30分)。皿をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回、滅菌水で2回洗います。皿を層流フードで風乾させ、密封されたビニール袋に入れて4°Cで最大1か月間保管します。
- AFMをキャリブレーションし、AFMに脳サンプルを設定します。注:メーカーのAFMキャリブレーション手順に従ってください。
- 公称ばね定数が0.03 N/mのAFMプローブと直径20 μmのホウケイ酸ビーズをプローブホルダーに慎重にロードします。
- サーマルチューン法を使用して、AFMカンチレバーのスプリング定数と逆光学レバー感度(InvOLS)を校正します。
注: AFMプローブのスプリング定数が計算されたら、繰り返し使用しても一定に保たれるはずです。ただし、カンチレバーInvOLSは、レーザーがカンチレバーと再調整されるたびに再校正する必要があります。さらに、キャリブレーションは、ポリスチレンなどのカンチレバーよりも数桁硬い基板に対して実行する必要があります。 - ステージマウントヒーターの電源を入れ、温度を37°Cに設定します。
- 脳スライスをP60皿にマウントします。
- 厚さ350 μmの脳スライスと丸底フラスコからの二酸化炭素(CO2)に依存しない培地を、ムール貝由来の生体接着剤でコーティングしたP60皿に静かに注ぎます。
- 脳のスライスをP60皿の中央にそっと傾けて配置します。必要に応じて、手動ピペットから培地をゆっくりとピペットで動かして、折りたたまれた脳スライスを展開するか、さらに良いことに、脳スライスを皿の中央に配置します。
- P1000ピペットを使用して余分なメディアを慎重に取り除きます(掃除機は使用しないでください)。
- を取り外し、P60ディッシュに取り付けたブレインスライスをAFMステージに置き、予熱したCO2に依存しない培地を~2ml加えます。
- AFMプローブにメディアを慎重に一滴加えて、脳スライスを囲むメディアに下げたときに表面張力による破損から保護します。
- AFMヘッドをステージ上に再配置し、メディアに沈むまでヘッドを下げ始めます。
- 上面図の電荷結合素子(CCD)カメラを使用して、レーザーをカンチレバーに再配置します。
注: カンチレバー上のレーザーの位置合わせは、空気と媒体の屈折率の違いによりわずかに変化します。 - カンチレバーが温かい液体に沈められるように調整されるまで5分間待ってから、ミラーの位置合わせを0 Vの自由たわみにリセットします。
- メーカーの指示に従って、AFMプローブで熱スペクトルを実行します。最初のサーマルピークのフィットを使用して、メディア中のAFMプローブのInvOLSを再計算します。
- 光学顕微鏡を使用して、関心のある脳領域がAFMプローブの下にくるようにサンプルステージを動かします。注:脳梁は、周囲の灰白質よりも不透明であるため、暗く見えます。皮質は脳梁よりも優れています。
- ミラーの位置合わせを0Vの自由たわみにリセットします。
- AFMソフトウェアのSum and Deflection Meterで、[Engage]をクリックしてAFMヘッドをかみ合わせます。
- AFMヘッドの位置ダイヤルを使用して、カンチレバーとサンプルが接触するまでヘッドを下げます。
- クリープコンプライアンス実験を実施します。
- ソフトウェアの関数エディタで加えられた力関数を構築します。力関数は、5 nN の設定ポイントまで 0.1 秒のランプを行い、それを 20 秒間保持した後、0 nN の力を加えるまで 1 秒間のランプで下降することで構成されます。
- インデントマスターパネルのインデント方法で、インデントモードに「ロード」、ユニットに「N」、インデンター機能に「ファンクションエディタ」を選択します。
- 関数エディタの[Segment Parms]パネルで、0 nN から開始し 5 nN で終了する力の関数セグメントを 0.1 秒の時間で作成します。[Insert -->] をクリックします。
- 次のセグメントでは、開始を5 nN、終了を5 nN、時間を20秒に設定します>。
- 最後のセグメントでは、開始を 5 nN、終了を 0 nN、時間を 1 秒に設定します。次に、「描画」をクリックして、関数エディタウィンドウを閉じます。
- マスターパネルのフォースタブで、「トリガー後のインデンターランプ」にチェックを入れ、適用されたフォース関数をトリガーポイント0.1Vに達した後にトリガーするように設定します。
- マスターパネルのフォースタブの下部にある「シングルフォース」をクリックすると、クリープコンプライアンスのために構築された力関数がトリガーされます。
- シングルフォースインデントが終了したら、AFMヘッドを持ち上げてサンプルと接触しないようにします。次に、ヘッドを再度かみ合わせ、自由たわみを再度ゼロにします。
- サンプルステージを再配置して新しい関心領域を特定し、AFMヘッドを下げて接触させます。注:サンプルステージを移動するときは、AFMヘッドをサンプル表面から引っ込める必要があります。そうしないと、繊細なAFMカンチレバーが損傷する可能性があります。
- 必要な量のデータが収集されるまで、手順を繰り返します。
- 力緩和実験を行います。
- ソフトウェアの関数エディタで適用されたインデント関数を作成します。インデンテーション機能は、3 μm の設定ポイントまで 0.1 秒のランプを行い、それを 20 秒間保持した後、インデントの深さ 0 μm まで 1 秒のランプで行います。
- インデント マスター パネルのインデント方法の下で、インデント モードの [Indentation] を選択します。 単位は「m」、圧子機能の場合は「Function editor」です。
- 関数エディタの[Segment Parms]パネルで、0 μm から開始して 3 μm で終了する力印加関数セグメントを 0.1 秒の時間で作成します。[Insert -->] をクリックします。
- 次のセグメントでは、開始を3 μm、終了を3 μm、時間を20秒に設定し、「Insert -->」をクリックします。
- 最終セグメントでは、開始を 3 μm、終了を 0 μm、時間を 1 秒に設定します。次に、「描画」をクリックして、関数エディタウィンドウを閉じます。
- マスターパネルの「フォース」タブで、「トリガー後のインデンターランプ」にチェックを入れ、トリガーポイント0.1Vに達した後にトリガーするように設定します。
- マスターパネルのフォースタブの下部にある「シングルフォース」をクリックすると、力の緩和のためのインデント関数が構築-適用されます。
- シングルフォースインデントが終了したら、AFMヘッドを持ち上げてサンプルと接触しないようにしてから、ヘッドを再度かみ合わせてたわみをゼロにします。
- ステージの位置を変更して新しい関心領域を見つけ、ヘッドを下げて接触させます。
- 必要な量のデータが収集されるまで、両方の測定を繰り返します。
